在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3等融合蛋白來示蹤自噬形成（常用）：GFP-LC3單熒光指示體系。由于電鏡耗時(shí)長(zhǎng)，不利于監(jiān)測(cè)（Monitoring）自噬形成。我們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了GFP-LC3指示技術(shù)：無自噬時(shí)，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時(shí)，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)自噬活性的高低。研載生物已開發(fā)出高效的評(píng)價(jià)用GFP-LC3病毒載體，通過瞬時(shí)高效傳染細(xì)胞，配合活細(xì)胞工作站成功評(píng)價(jià)自噬流。研究發(fā)現(xiàn)，IPMK對(duì)自噬活性的調(diào)控依賴于轉(zhuǎn)錄因子TFEB的活性。北京GFP-LC3單熒光自噬慢病毒包裝
自噬的步驟可以大概總結(jié)為下面四步：步驟1：細(xì)胞接受自噬誘導(dǎo)信號(hào)后，在胞漿的某處形成一個(gè)小的類似「脂質(zhì)體」樣的膜結(jié)構(gòu)，然后不斷擴(kuò)張，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一個(gè)由2層脂雙層組成的碗，可在電鏡下觀察到，被稱為Phagophore，是自噬發(fā)生的鐵證之一。步驟2：Phagophore不斷延伸，將胞漿中的任何成分，包括細(xì)胞器，全部攬入「碗」中，然后「收口」，成為密閉的球狀的autophagosome，即「自噬體」。電鏡下觀察到自噬體是自噬發(fā)生的鐵證之二。有2個(gè)特征：一是雙層膜，二是內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片等。步驟3：自噬體形成后，可與細(xì)胞內(nèi)吞的吞噬泡、吞飲泡和內(nèi)體融合（這種情況不是必然要發(fā)生的）。步驟4：自噬體與溶酶體融合形成autolysosome，期間自噬體的內(nèi)膜被溶酶體酶降解，二者的內(nèi)容物合為一體，自噬體中的「貨物」也被降解，產(chǎn)物（氨基酸、脂肪酸等）被輸送到胞漿中，供細(xì)胞重新利用，而殘?jiān)虮慌懦黾?xì)胞外或滯留在胞漿中。江蘇雙熒光自噬慢病毒自噬通過分解并清理受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器來達(dá)到清潔細(xì)胞的效果。
細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)或阻止后，需對(duì)自噬過程進(jìn)行觀察和檢測(cè)，常用的策略和技術(shù)有：觀察自噬體的形成。由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為：新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢(shì)。自噬體（AV1）的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體（AV2）的特征為：?jiǎn)螌幽?，胞漿成分已降解。我們?cè)陲@微鏡成像后紅綠熒光merge后通過merge后出現(xiàn)的黃色斑點(diǎn)即只是自噬體.紅色的斑點(diǎn)指示自噬溶酶體,通過不同顏色斑點(diǎn)的計(jì)數(shù)可以清晰的看出自噬流的強(qiáng)弱。
細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)或阻止后，需對(duì)自噬過程進(jìn)行觀察和檢測(cè)，常用的策略和技術(shù)有：1、利用WesternBlot檢測(cè)LC3-II/I比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成自噬形成時(shí)，胞漿型LC3（即LC3-I）會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低。（注意：LC3抗體對(duì)LC3-II有更高的親和力，會(huì)造成假陽性。方法2和3需結(jié)合使用，同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響。）2、檢測(cè)長(zhǎng)壽蛋白的批量降解：非特異。3、MDC（Monodansylcadaverine，單丹磺酰尸胺）染色：包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。4、CellTrackerTMGreen染色：主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也是屬于非特異性的。自噬作用是普遍存在于大部分真核細(xì)胞中的一種現(xiàn)象。
自噬過程的調(diào)控：從自噬特點(diǎn)中可以看出，自噬這一過程一旦啟動(dòng)，必須在度過危機(jī)后適時(shí)停止，否則，其非特異性捕獲胞漿成分的特性將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷。這也提醒我們?cè)谘芯孔允蓵r(shí)一定要?jiǎng)討B(tài)觀察，任何橫斷面的研究結(jié)果都不足以評(píng)價(jià)自噬的活性。目前，已經(jīng)報(bào)告了比較多因素能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，如饑餓、生長(zhǎng)因子缺乏、微生物傳染、細(xì)胞器損傷、蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤或聚集、DNA損傷、放療、化療等等，這么多刺激信號(hào)如何傳遞的、哪些自噬蛋白接受信號(hào)、又有哪些自噬蛋白去執(zhí)行等比較多問題都還在等待進(jìn)一步解答中。自噬字面上理解就是自己吃自己，細(xì)胞把不用的大分子或是衰老損傷的細(xì)胞器分解再利用。自噬的信號(hào)通路非常復(fù)雜，有許多蛋白都可作為調(diào)控自噬的靶點(diǎn)，并針對(duì)其開發(fā)藥物。福建單熒光自噬慢病毒包裝
自噬是細(xì)胞蛋白降解的機(jī)制之一。北京GFP-LC3單熒光自噬慢病毒包裝
當(dāng)自噬體與溶酶體融合后，形成自噬溶酶體。自噬性溶酶體是一種自體吞噬泡,作用底物是內(nèi)源性的,即細(xì)胞內(nèi)的蛻變、破損的某些細(xì)胞器或局部細(xì)胞質(zhì)。這種溶酶體普遍存在于正常的細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)起“清道夫”作用，作為細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和其它結(jié)構(gòu)自然減員和更新的正常途徑。在組織細(xì)胞受到各種理化因素傷害時(shí)，自噬性溶酶體大量增加的，因此對(duì)細(xì)胞的損傷起一種保護(hù)作用。自噬性溶酶體的作用底物是內(nèi)源性的，即來自細(xì)胞內(nèi)的衰老和崩解的細(xì)胞器或局部細(xì)胞質(zhì)等。它們由單層膜包圍，內(nèi)部常含有尚未分解的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基復(fù)合體或脂類、糖原等。正常細(xì)胞中的自噬性溶酶體在消化、分解、自然更替一些細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)上起著重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到藥物作用、射線照射和機(jī)械損傷時(shí)，其數(shù)量明顯地增多。在病變的細(xì)胞中也常可見到自噬性溶酶體。北京GFP-LC3單熒光自噬慢病毒包裝