肝病中瘤免疫與自噬的關(guān)系尚未完全明確。研究表明,缺乏自噬的肝臟Kupffer細(xì)胞可以通過mtROS-NF-κB-IL-1a/b通路促進(jìn)肝硬化和肝病發(fā)展。自噬缺陷協(xié)同脂質(zhì)堆積可造成肝內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞耗竭。細(xì)胞自噬還被證實(shí)可被誘導(dǎo)增強(qiáng)TGFβ介導(dǎo)的抗瘤作用,IFNγ可通過非凋亡性細(xì)胞死亡抑制Huh7肝病細(xì)胞增殖,敲除自噬后,IFNγ抑制肝病細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)肝病細(xì)胞死亡的作用消失。研究表明自噬可通過抑制抑病基因的表達(dá)或活化原病基因促進(jìn)肝病發(fā)生。在ATG5敲除的小鼠模型中,由于自噬缺陷,抑病基因p53表達(dá)增加,小鼠只發(fā)生肝良性瘤而不惡變。這進(jìn)一步提示,自噬在肝病發(fā)生中的作用及機(jī)制非常復(fù)雜,可能受到諸多因素調(diào)控,但其重要性則毋庸置疑,仍需更多的研究探索其機(jī)制。誘導(dǎo)與吞噬泡形成:為應(yīng)對(duì)多種刺激,通過形成一種獨(dú)特的平整細(xì)胞膜(吞噬泡)誘導(dǎo)自噬。山東自噬RFP-GFP-LC3B
當(dāng)自噬體與溶酶體融合后,形成自噬溶酶體。自噬性溶酶體是一種自體吞噬泡,作用底物是內(nèi)源性的,即細(xì)胞內(nèi)的蛻變、破損的某些細(xì)胞器或局部細(xì)胞質(zhì)。這種溶酶體普遍存在于正常的細(xì)胞內(nèi),在細(xì)胞內(nèi)起“清道夫”作用,作為細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和其它結(jié)構(gòu)自然減員和更新的正常途徑。在組織細(xì)胞受到各種理化因素傷害時(shí),自噬性溶酶體大量增加的,因此對(duì)細(xì)胞的損傷起一種保護(hù)作用。自噬性溶酶體的作用底物是內(nèi)源性的,即來自細(xì)胞內(nèi)的衰老和崩解的細(xì)胞器或局部細(xì)胞質(zhì)等。它們由單層膜包圍,內(nèi)部常含有尚未分解的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基復(fù)合體或脂類、糖原等。正常細(xì)胞中的自噬性溶酶體在消化、分解、自然更替一些細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)上起著重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到藥物作用、射線照射和機(jī)械損傷時(shí),其數(shù)量明顯地增多。在病變的細(xì)胞中也??梢姷阶允尚匀苊阁w。自噬性溶酶體是一種自體吞噬泡,作用底物是內(nèi)源性的,即細(xì)胞內(nèi)的蛻變、破損的某些細(xì)胞器或局部細(xì)胞質(zhì)。河南自噬間歇性活化自噬對(duì)于藥物副作用突出的患者更為有利。
在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3等融合蛋白來示蹤自噬形成(常用):GFP-LC3單熒光指示體系。由于電鏡耗時(shí)長(zhǎng),不利于監(jiān)測(cè)(Monitoring)自噬形成。我們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了GFP-LC3指示技術(shù):無自噬時(shí),GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中;自噬形成時(shí),GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜,在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn),一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體,可以通過計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)自噬活性的高低。研載生物已開發(fā)出高效的評(píng)價(jià)用GFP-LC3病毒載體,通過瞬時(shí)高效傳染細(xì)胞,配合活細(xì)胞工作站成功評(píng)價(jià)自噬流。
在大腦自噬的過程中,可以增強(qiáng)線粒體功能(細(xì)胞中產(chǎn)生能量的部分),保持線粒體平穩(wěn)運(yùn)行,會(huì)讓細(xì)胞可以產(chǎn)生更多的能量來為你的身體提供能量。自噬可以觸發(fā)細(xì)胞死亡,清理已經(jīng)被活性氧氧化應(yīng)激所破壞而無法修復(fù)的細(xì)胞(包括舊有的和新有的),損壞細(xì)胞死亡時(shí),它們?yōu)樾碌募?xì)胞進(jìn)入并接管提供了空間。自噬就像對(duì)細(xì)胞進(jìn)行大掃除,在自噬過程中,你體內(nèi)的老的細(xì)胞膜,細(xì)胞器,其他細(xì)胞碎片,會(huì)被移除,重新?lián)Q成全新的部件。用更閃亮的新版本替換所有舊的或損壞的部件。你的細(xì)胞會(huì)變得更年輕,從而使身體更加高效的運(yùn)行。總之,自噬可以幫助你更長(zhǎng)壽,更年輕,恢復(fù)的更快,你可以每天做一些事情來啟動(dòng)細(xì)胞自噬,刺激細(xì)胞自噬來使它們更新。推動(dòng)關(guān)系中自噬并不直接參與誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,而是作為能量供應(yīng)者保障凋亡順利進(jìn)行。
細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)或阻止后,需對(duì)自噬過程進(jìn)行觀察和檢測(cè),常用的策略和技術(shù)有:1、利用WesternBlot檢測(cè)LC3-II/I比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成自噬形成時(shí),胞漿型LC3(即LC3-I)會(huì)酶解掉一小段多肽,轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低。(注意:LC3抗體對(duì)LC3-II有更高的親和力,會(huì)造成假陽(yáng)性。方法2和3需結(jié)合使用,同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響。)2、檢測(cè)長(zhǎng)壽蛋白的批量降解:非特異。3、MDC(Monodansylcadaverine,單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體,所有酸性液泡都被染色,故屬于非特異性的。4、CellTrackerTMGreen染色:主要用于雙染色,但其能染所有的液泡,故也是屬于非特異性的。自噬在肝病發(fā)生中的作用及機(jī)制復(fù)雜,受到諸多因素調(diào)控,但其重要性毋庸置疑,仍需更多的研究探索其機(jī)制。杭州細(xì)胞自噬GFP-LC3B
當(dāng)自噬體與溶酶體融合后,因GFP熒光的部分淬滅而以紅色斑點(diǎn)的形式表現(xiàn)出來。山東自噬RFP-GFP-LC3B
自噬是一個(gè)吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡,并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內(nèi)容物的過程,借此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。自噬在機(jī)體的生理和病理過程中都能見到,其所起的作用是正面還是負(fù)面的尚未完全闡明,對(duì)病變的研究尤其如此,值得關(guān)注。自噬(autophagy)是由Ashford和Porter在1962年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有“自己吃自己”的現(xiàn)象后提出的,是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體(autophagosome),并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內(nèi)容物,以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。山東自噬RFP-GFP-LC3B