自噬雙標(biāo)系統(tǒng)的工作原理為：未發(fā)生自噬的細(xì)胞及含有自噬體的細(xì)胞中，由于mCherry與GFP共同表達(dá)，細(xì)胞呈現(xiàn)黃色熒光。當(dāng)自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體后，酸性的溶酶體環(huán)境使酸敏感的GFP熒光淬滅，而mCherry不受影響，進(jìn)而使自噬溶酶體呈現(xiàn)紅色熒光。因此，紅色熒光可指示自噬溶酶體形成的順利程度。紅色熒光越多，綠色熒光越少，則從自噬體到自噬溶酶體階段流通得越順暢。反之，自噬體和溶酶體融合被阻止，自噬溶酶體進(jìn)程受阻。在組織細(xì)胞受到各種理化因素傷害時(shí)，自噬性溶酶體大量增加，因此對細(xì)胞的損傷起一種保護(hù)作用。北京wb檢測自噬
根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)到溶酶體內(nèi)的途徑不同，自噬分為以下幾種。①大自噬：由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體或細(xì)胞質(zhì)膜等來源的膜包繞待降解物形成自噬體，然后與溶酶體融合并降解其內(nèi)容物；②小自噬：溶酶體的膜直接包裹長壽命蛋白等，并在溶酶體內(nèi)降解；③分子伴侶介導(dǎo)的自噬（chaperonemediatedautophagy,CMA）：胞質(zhì)內(nèi)蛋白結(jié)合到分子伴侶后被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔中，然后被溶酶體酶消化。CMA的底物是可溶的蛋白質(zhì)分子，在清理蛋白質(zhì)時(shí)有選擇性，而前兩者無明顯的選擇性。中間雙重細(xì)胞膜囊泡是一種自噬體，可與溶酶體相結(jié)合，形成自噬體。浙江細(xì)胞自噬慢病毒自噬功能不全的細(xì)胞易于壞死，但是壞死組織產(chǎn)生的細(xì)胞因子（包括部分生長因子）反而會促進(jìn)病變的生長。
GFP-LC3B 融合蛋白不僅能夠利用其熒光標(biāo)簽進(jìn)行檢測，還可利用溶酶體對標(biāo)簽蛋白的切割通過 Western blot進(jìn)行檢測。GFP-LC3B 蛋白進(jìn)入到自噬溶酶體內(nèi)后 LC3B 部分對溶酶體中的蛋白水解酶較為敏感，較容易被降解。而融合蛋白中的 GFP 部分則對于溶酶體中的蛋白水解酶敏感性較低，不容易被降解。使用GFP 抗體進(jìn)行 Western blot 檢測可能會檢測到 GFP-LC3B-I、GFP-LC3B-II 和游離 GFP 標(biāo)簽三個條帶，若出現(xiàn)游離 GFP 標(biāo)簽條帶則daibiao細(xì)胞自噬流活化。此外, 在檢測同一細(xì)胞樣品時(shí)還可以使用 LC3B 抗體檢測內(nèi)源性 LC3B-I 向 LC3B-II 轉(zhuǎn)化。
什么是自噬？簡單來說，細(xì)胞自噬，就好像一臺電腦，用時(shí)間長了，出問題了，而斷食引發(fā)的細(xì)胞自噬，就像是給它重裝系統(tǒng)，讓它煥然一新。自噬（Autophagy），希臘語“auto”（自我）和“phagein”（進(jìn)食），直接翻譯過來就是，自己吃自己。從專業(yè)上說是，細(xì)胞溶質(zhì)的成分被降解，然后通過溶酶體（細(xì)胞里面有一個專門的小隔間，里面有消化蛋白質(zhì)，碳水，和脂肪的酶，專門管這個小隔間叫做溶酶體（lysosome）），回收細(xì)胞中損壞的元件，循環(huán)再利用，組成一個新的細(xì)胞。自噬可以觸發(fā)細(xì)胞死亡，清理已經(jīng)被活性氧氧化應(yīng)激所破壞而無法修復(fù)的細(xì)胞。
過繼免疫細(xì)胞治理是指將具有抗瘤效應(yīng)的自體或異體細(xì)胞在體外進(jìn)行誘導(dǎo)、啟動或修飾并擴(kuò)增后回輸給瘤患者，再轉(zhuǎn)移到病灶，以達(dá)到治理及預(yù)防復(fù)發(fā)之目的，常用的過繼細(xì)胞有細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）、瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）以及基因修飾T淋巴細(xì)胞。自噬可促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）成熟，并調(diào)節(jié)NK細(xì)胞內(nèi)部穩(wěn)態(tài)和抗瘤作用，且自噬可通過細(xì)胞因子途徑或ROS途徑調(diào)控T淋巴細(xì)胞胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、免疫功能及記憶T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生等，故理論上來說自噬在該治理中影響較大，但可能該治理現(xiàn)開展較少，尚未有針對自噬的藥物聯(lián)合其治理肝病的研究報(bào)道。自噬可通過調(diào)控免疫來發(fā)揮抗瘤作用。山東western blot檢測自噬
自噬在肝病發(fā)生中的作用及機(jī)制復(fù)雜，受到諸多因素調(diào)控，但其重要性毋庸置疑，仍需更多的研究探索其機(jī)制。北京wb檢測自噬
在研究自噬與凋亡的關(guān)系時(shí)，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡前胞漿中存在大量的自噬體或自噬溶酶體，但這樣的細(xì)胞缺乏凋亡的典型特點(diǎn)，如核固縮）,核破裂、細(xì)胞皺縮、沒有凋亡小體的形成等，被稱為自噬樣細(xì)胞死亡，它是一種新的細(xì)胞程序性死亡，為了與凋亡區(qū)別，被命名為TypeIIcelldeath，相應(yīng)的，凋亡為TypeIcelldeath，壞死為TypeIIIcelldeath。盡管這樣，但對于自噬是否是細(xì)胞死亡的直接原因目前還存在比較大的爭議。到底是Celldeathbyautophagy（自噬引起死亡）還是Celldeathwithautophagy（死亡時(shí)有自噬發(fā)生，但不是直接原因）？對此，自噬研究領(lǐng)域“大?！奔墝＜襆evineBeth在一篇nature的Review中表達(dá)了自己的觀點(diǎn)。由于在形態(tài)學(xué)上2者無明顯區(qū)別，但通過阻斷自噬，觀察細(xì)胞的結(jié)局可區(qū)分開來：Celldeathbyautophagy細(xì)胞存活，而Celldeathwithautophagy細(xì)胞死亡。自噬既能阻止也能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，兩種反應(yīng)在生物體內(nèi)普遍存在。北京wb檢測自噬