廣東動物血液樣本細(xì)胞焦亡

來源: 發(fā)布時(shí)間:2022-04-02

細(xì)胞焦亡的機(jī)制中GSDMD的切割,IL-1β和IL-18前體的切割成熟和釋放是關(guān)鍵信號,因此證明所誘發(fā)的細(xì)胞死亡方式是否為細(xì)胞焦亡,需要幾個(gè)關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)證據(jù):(1)GSDMD的切割(Western檢測);(2)Caspase的激huo,主要是Caspase-1,Caspase-4,Caspase-5,Caspase-11。(Western檢測);(3)IL-1β和IL-18前體的切割成熟和釋放(Western,ELISA等);(4)細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(CCK-8等);(5)染色質(zhì)完整性檢測(Tunel等)。完整檢測方式如下:1、形態(tài)變化(1)掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài);(2)免疫熒光染色(GSDMD/GSDME);(3)Tunel檢測。2、檢測焦亡相關(guān)基因及蛋白(1)q-PCR/WesternBlot方法檢測焦亡相關(guān)基因或蛋白的表達(dá)水平(例如,Caspase-1、4、5、11;GSDMD;CleavedCaspase-3、IL-1β、IL-18、NLRP3、ASC等);(2)ELISA試劑盒檢測炎癥因子的水平;(3)CCK8法測定細(xì)胞活力;(4)免疫組化檢測組織蛋白的表達(dá)細(xì)胞焦亡、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、細(xì)胞壞死性凋亡都是程序性死亡的表現(xiàn)形式。廣東動物血液樣本細(xì)胞焦亡

細(xì)胞焦亡屬于炎癥性死亡途徑,按激huo機(jī)制,可分為Caspase-1依賴和不依賴兩種途徑。兩種途徑都是通過切割GSDMD后形成N端游離的肽段,這一肽段會誘導(dǎo)細(xì)胞形成孔道并導(dǎo)致細(xì)胞破裂,釋放胞質(zhì)成分。兩種途徑都能同時(shí)誘導(dǎo)IL-1β和IL-18的前體進(jìn)行切割,形成成熟的IL-1β和IL-18。不同的只是是否直接激huoCaspase-1。炎性小體激huo的分子機(jī)制與焦亡的誘導(dǎo)發(fā)生需要兩步機(jī)制:第一步是啟動步驟,促炎因子如 proIL-1β、Nlrp3和caspase-11等的轉(zhuǎn)錄生成。第二步是激huo炎性復(fù)合物,炎性復(fù)合物包括NLR(NOD-like receptors,胞漿內(nèi)感受器)蛋白家族成員、銜接蛋白ASC/TMS1和Pro-Caspase-1,其中NLR蛋白家族成員中NLRP3是細(xì)胞焦亡中的主要炎性復(fù)合物。北京樣本細(xì)胞焦亡化療藥物通過Caspase-3切割GSDME誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。

細(xì)胞焦亡是機(jī)體重要天然免疫反應(yīng),在拮抗感ran和內(nèi)源危險(xiǎn)信號中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞焦亡廣fan參與感ran性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病和動脈粥樣ying化性疾病等的發(fā)生fa展,對細(xì)胞焦亡的深入研究有助于認(rèn)識其在相關(guān)疾病發(fā)生fa展和轉(zhuǎn)歸中的作用,為臨床防治提供新思路。近幾年,細(xì)胞焦亡的研究熱度迅猛上升,已成功吸引科學(xué)家們的眼球,一躍成為熱門研究領(lǐng)域。細(xì)胞焦亡(pyroptosis)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)、細(xì)胞自噬(autophagy)、細(xì)胞壞死性凋亡(necroptosis)都是程序性死亡(ProgrammedCellDeath,PCD)的表現(xiàn)形式,程序性細(xì)胞死亡是指細(xì)胞接受某種信號或受到某些因素刺激后,為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的一種主動性消亡過程。細(xì)胞凋亡由凋亡性caspase(Caspase-2,3,6,7,8,9或人類caspase-10)介導(dǎo)。與細(xì)胞凋亡相比,細(xì)胞焦亡是由炎癥性caspase(Caspase-1,4,5,11)誘導(dǎo)的一類壞死性和炎癥性的細(xì)胞程序性死亡。相比于細(xì)胞凋亡,細(xì)胞焦亡發(fā)生的更快,并會伴隨著大量促炎癥因子的釋放。由于細(xì)胞焦亡需要炎癥性caspase的參與,其與另一種壞死性和炎癥性的細(xì)胞程序性死亡方式—壞死性凋亡不一樣,壞死性凋亡發(fā)生不需要caspase的參與。

有意思的是,這兩個(gè)篩選都鑒定到了一個(gè)名為GSDMD的、功能未知的蛋白。通過構(gòu)建GSDMD基因敲除的小鼠巨噬細(xì)胞和人的HeLa細(xì)胞,他們進(jìn)一步驗(yàn)證了GSDMD缺失可以完全抑制所有已知炎癥小體和細(xì)菌LPS引起的細(xì)胞焦亡;并且在這些敲除的細(xì)胞中外源表達(dá)GSDMD都可以回復(fù)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。有趣的是,GSDMD缺失并不抑制caspase-1本身的激huo和對下游白介素1β的切割,但切割后成熟的白介素1β卻幾乎不能分泌到細(xì)胞外,顯示細(xì)胞焦亡對于白介素1β的分泌必不可少,該結(jié)果也暗示GSDMD在炎性caspase的下游發(fā)揮作用。通過生物化學(xué)的研究,他們發(fā)現(xiàn)GSDMD是所有炎性caspase的共有底物,它們特異性的切割GSDMD兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中間的連接區(qū)域,而凋亡相關(guān)的caspases卻不具備該活性;將不能被caspase-1/4/5/11切割的GSDMD回補(bǔ)到GSDMD敲除的細(xì)胞也不能介導(dǎo)細(xì)胞焦亡發(fā)生,說明該切割對于細(xì)胞焦亡是必需的。細(xì)胞焦亡是機(jī)體重要天然免疫反應(yīng)。

炎性caspase家族蛋白——包括caspase1,4,5,11(其中4,5存在于人中),對于免疫反應(yīng)的信號傳遞起到了關(guān)鍵的作用。它們是組成"炎癥小體"(inflammasome)的重要元件,后者介導(dǎo)了多種促炎性分子(pro-IL-1beta,pro-IL-18)的表達(dá)與分泌。炎性caspase同時(shí)還參與了一類叫做"細(xì)胞焦亡"的事件的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)證明,革蘭氏陰性菌中的脂多糖(LPS)能夠激huo宿主體內(nèi)caspase1或者caspace4,5活性,也有實(shí)驗(yàn)證明caspase4,5,11能夠與LPS直接結(jié)合。這些炎性caspase的激huo能夠促進(jìn)細(xì)胞焦亡事件的發(fā)生,同時(shí)能夠激huoNLRP3炎癥小體,并引發(fā)熱休克癥狀。然而,炎性caspase究竟是如何調(diào)節(jié)這些細(xì)胞事件至今仍然有待解決。**近,來自UCSF的VishvaMDixit研究組與來自NIBS的邵峰研究組分別發(fā)現(xiàn)了一類炎性caspase的關(guān)鍵性底物:gasderminD,該蛋白的切割能夠引發(fā)細(xì)胞焦亡事件的發(fā)生。其中,Dixit等人利用正向遺傳學(xué)的手段對小鼠進(jìn)行了大規(guī)模的基因誘變,并從中篩選能夠抑制caspase11信號通路的基因。該基因名為Gsdmd,存在一個(gè)105位的異亮氨酸到賴氨酸的突變。他們發(fā)現(xiàn)這一突變體小鼠不能夠正常發(fā)生細(xì)胞焦亡,而且在轉(zhuǎn)染LPS后也不能夠正常產(chǎn)生IL-1β。細(xì)胞焦亡兩種途徑不同的只是是否直接激huoCaspase-1。北京整體實(shí)驗(yàn)細(xì)胞焦亡價(jià)格比較

細(xì)胞焦亡是由gasdermin介導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死。廣東動物血液樣本細(xì)胞焦亡

細(xì)胞焦亡(pyroptosis)是一種近期發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞程序性死亡方式,表現(xiàn)為細(xì)胞不斷脹大直至細(xì)胞膜破裂,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的釋放進(jìn)而激huo強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。自2015年以來,邵峰院士等人發(fā)現(xiàn),caspase-1和caspase-11/4/5是通過切割一個(gè)叫做Gasdermin-D(GSDMD)的蛋白而誘發(fā)細(xì)胞焦亡的,GSDMD在被caspase-1或caspase-11/4/5切割后,釋放出其N端結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域具有結(jié)合膜脂并在細(xì)胞膜上打孔的活性,這樣就導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓的變化而發(fā)生脹大直至細(xì)胞膜的破裂(Shi et al., Nature 2015;Ding et al., Nature 2016)。廣東動物血液樣本細(xì)胞焦亡