自噬的步驟可以大概總結(jié)為下面四步:步驟1:細(xì)胞接受自噬誘導(dǎo)信號(hào)后,在胞漿的某處形成一個(gè)小的類(lèi)似「脂質(zhì)體」樣的膜結(jié)構(gòu),然后不斷擴(kuò)張,但它并不呈球形,而是扁平的,就像一個(gè)由2層脂雙層組成的碗,可在電鏡下觀察到,被稱(chēng)為Phagophore,是自噬發(fā)生的鐵證之一。步驟2:Phagophore不斷延伸,將胞漿中的任何成分,包括細(xì)胞器,全部攬入「碗」中,然后「收口」,成為密閉的球狀的autophagosome,即「自噬體」。電鏡下觀察到自噬體是自噬發(fā)生的鐵證之二。有2個(gè)特征:一是雙層膜,二是內(nèi)含胞漿成分,如線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片等。步驟3:自噬體形成后,可與細(xì)胞內(nèi)吞的吞噬泡、吞飲泡和內(nèi)體融合(這種情況不是必然要發(fā)生的)。步驟4:自噬體與溶酶體融合形成autolysosome,期間自噬體的內(nèi)膜被溶酶體酶降解,二者的內(nèi)容物合為一體,自噬體中的「貨物」也被降解,產(chǎn)物(氨基酸、脂肪酸等)被輸送到胞漿中,供細(xì)胞重新利用,而殘?jiān)虮慌懦黾?xì)胞外或滯留在胞漿中。自噬紊亂可能在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化等其他自身免疫病的發(fā)生中起到一定作用。吉林mRFP-GFP-LC3雙熒光自噬慢病毒包裝
溶酶體的作用還包括對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的消化,溶酶體能消化分解經(jīng)胞吞作用攝入細(xì)胞內(nèi)的各種物質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)衰亡或損傷的各種細(xì)胞器等。吞噬性溶酶體內(nèi)的各種大分子在水解酶的作用下,可以被分解為簡(jiǎn)單物質(zhì)。例如,能將蛋白質(zhì)分解為二肽或游離氨基酸;把核酸分解為核苷和磷酸;使碳水化合物分解為寡糖類(lèi)或單糖;將中性脂肪分解為甘油和脂肪酸等。這些被分解而生成的可溶性小分子物質(zhì),能透過(guò)溶酶體體膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)基質(zhì),重新參與細(xì)胞的物質(zhì)代謝,一些未被完全消化的物質(zhì)殘留下來(lái),形成殘余小體。成都雙熒光自噬慢病毒包裝細(xì)胞自噬過(guò)程的功能紊亂與多種疾病相關(guān),包括病癥、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病等。
根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)到溶酶體內(nèi)的途徑不同,自噬分為以下幾種。①大自噬:由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體或細(xì)胞質(zhì)膜等來(lái)源的膜包繞待降解物形成自噬體,然后與溶酶體融合并降解其內(nèi)容物;②小自噬:溶酶體的膜直接包裹長(zhǎng)壽命蛋白等,并在溶酶體內(nèi)降解;③分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperonemediatedautophagy,CMA):胞質(zhì)內(nèi)蛋白結(jié)合到分子伴侶后被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔中,然后被溶酶體酶消化。CMA的底物是可溶的蛋白質(zhì)分子,在清理蛋白質(zhì)時(shí)有選擇性,而前兩者無(wú)明顯的選擇性。中間雙重細(xì)胞膜囊泡是一種自噬體,可與溶酶體相結(jié)合,形成自噬體。
自噬阻止劑可以通過(guò)阻止自噬通路中的某種蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)阻止自噬,也可以通過(guò)直接擾亂溶酶體功能來(lái)阻止自噬,因?yàn)槿苊阁w是自噬完成的關(guān)鍵場(chǎng)所。氯喹和羥氯喹是兩種臨床中常用的藥物,較早它們被用于調(diào)整瘧疾,后來(lái)又發(fā)現(xiàn)其對(duì)SLE等病有效,它們都是通過(guò)降低溶酶體酸性、擾亂溶酶體功能來(lái)阻止自噬的。這些分子現(xiàn)在也在臨床實(shí)驗(yàn)中與化療藥物聯(lián)用以降低耐藥性。解決特異性不足的一個(gè)未來(lái)的研究方向,是針對(duì)特異性更高的靶點(diǎn)(即該蛋白只存在于自噬通路中)開(kāi)發(fā)阻止劑/激動(dòng)劑。另外,針對(duì)系統(tǒng)性的脫靶效應(yīng),可以通過(guò)靶向遞送的方式將脫靶效應(yīng)降至較低,例如將自噬阻止劑與化療藥物連接在同一個(gè)靶向到病變的藥物載體上,使其只影響病變中的自噬水平而不干擾免疫系統(tǒng)。在自噬過(guò)程中,通過(guò)壓力誘導(dǎo)自噬后,細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)被自噬體的雙膜結(jié)構(gòu)隔離。自噬能夠明顯抑制造血干細(xì)胞的代謝,能夠清理線(xiàn)粒體堆積,保持自我的再生能力。
自噬過(guò)程的調(diào)控:自噬這一過(guò)程一旦啟動(dòng),必須在度過(guò)危機(jī)后適時(shí)停止,否則,其非特異性捕獲胞漿成分的特性將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷。這也提醒我們?cè)谘芯孔允蓵r(shí)一定要?jiǎng)討B(tài)觀察,任何橫斷面的研究結(jié)果都不足以評(píng)價(jià)自噬的活性。目前,已經(jīng)報(bào)告了許多因素能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬,如饑餓、生長(zhǎng)因子缺乏、微生物傳染、細(xì)胞器損傷、蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤或聚集、DNA損傷、放療、化療等等,這么多刺激信號(hào)如何傳遞的、哪些自噬蛋白接受信號(hào)、又有哪些自噬蛋白去執(zhí)行等許多問(wèn)題都還在等待進(jìn)一步解答中。關(guān)于傳遞自噬信號(hào)的通路目前比較肯定的有:阻止類(lèi)ClassIPI3Kpathway(PI-phosphatidylinositol,磷脂酰肌醇)與IRS(Insulinreceptorsubstrate)結(jié)合,接受胰島素受體傳來(lái)的信號(hào)(血糖水平高阻止自噬)。微自噬可以起到將糖原運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中的作用。西安細(xì)胞自噬
融合、降解與回收:完全形成的自噬體與溶酶體在細(xì)胞內(nèi)相融合。吉林mRFP-GFP-LC3雙熒光自噬慢病毒包裝
自噬體是自噬的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)。自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),直徑一般為300~900nm,平均500nm,普通光鏡下看不到。通過(guò)透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)自噬體一直是觀察自噬現(xiàn)象常用的方法,是自噬檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)是使用較多的一類(lèi)電鏡。通過(guò)發(fā)射電子束從而穿過(guò)超薄的樣品,同時(shí)與樣本相互作用,既而形成圖像。透射電鏡具有分辨率高和放大倍數(shù)高的優(yōu)點(diǎn)。其分辨率為0.1-0.2nm,放大倍數(shù)為幾萬(wàn)到幾十萬(wàn)倍。吉林mRFP-GFP-LC3雙熒光自噬慢病毒包裝