通常情況下,除了研究自噬現(xiàn)象本身,大家更多的是將自噬與各種生命活動(dòng)或者疾病結(jié)合起來,把自噬作為這些方向的一個(gè)機(jī)制來研究。通常的研究模式:1)證明自噬參與了相關(guān)研究表型(電鏡、LC3II/I-WB、LC3亞細(xì)胞定位、LC3熒光示蹤監(jiān)測(cè)自噬流等)2)證明自噬在表型中起到關(guān)鍵作用(通過自噬抑制劑、激動(dòng)劑進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究)3)找到表型與自噬橋梁分子(檢測(cè)pI3K通路、Beclin-1、ATG家族各成員)4)在基因?qū)用嫱ㄟ^gainof/lostoffunction研究橋梁分子在自噬中的作用。細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的增加和線粒體膜電位的減少也能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。成都自噬通路
微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3/Atg8)是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白。細(xì)胞內(nèi)存在兩種形式的LC3蛋白,LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。細(xì)胞內(nèi)新合成的LC3其C端被Atg4蛋白酶剪切,成為胞質(zhì)可溶形式的LC3-Ⅰ。當(dāng)自噬體形成后,LC3-Ⅰ經(jīng)剪切和泛素化加工修飾。與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)偶聯(lián),成為膜結(jié)合形式的LC3-Ⅱ并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜,因此LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可以估計(jì)自噬水平的高低。
除了LC3,自噬體膜上標(biāo)志性蛋白質(zhì)還有Atg12-Atg5結(jié)合體。Atg12和Atg5在翻譯后就像單個(gè)分子一樣共價(jià)結(jié)合在一起,它定位在自噬體雙層隔離膜的整個(gè)延長階段。 蘇州自噬透射電鏡自噬可通過調(diào)控免疫來發(fā)揮抗瘤作用。
自噬在病變發(fā)生的不同階段扮演了完全不同的角色。作為正常細(xì)胞生命活動(dòng)所必需的一種過程,自噬水平低下可導(dǎo)致細(xì)胞病變。例如,在胃病和結(jié)腸病等病變細(xì)胞中,經(jīng)??捎^察到和Beclin-1密切相關(guān)的蛋白BIF-1突變或缺失,而Beclin-1是自噬信號(hào)通路中的一種關(guān)鍵蛋白。在小鼠模型中,敲除自噬相關(guān)蛋白Atg7和Atg5可誘發(fā)肝病。進(jìn)一步研究表明,自噬可以清理受損線粒體,從而避免受損線粒體產(chǎn)生大量活性氧(ReactiveOxygenSpecies,ROS),而活性氧可以對(duì)DNA等遺傳物質(zhì)造成損傷進(jìn)而致病。從這個(gè)角度來說,在一些病變發(fā)生的早期,促進(jìn)自噬可能是一條可行的抗病變途徑。
我國肝病發(fā)生的原因多見于慢性HBV和HCV沾染,此外還與酒精性及非酒精性脂肪肝相關(guān)。HBV誘導(dǎo)的肝細(xì)胞自噬通常是由HBVx蛋白誘導(dǎo)的,HBx是HBVx基因編碼的一種多功能潛在性蛋白,在慢性肝炎、肝硬化和肝病中發(fā)揮重要作用。HBx可通過抑制Beclin1與bcl-2結(jié)合和JNK-ROS信號(hào)通路啟動(dòng)自噬。其他HBV蛋白如HBsAg可通過與折疊錯(cuò)誤的蛋白結(jié)合誘導(dǎo)自噬。但有趣的是,自噬的發(fā)生在肝病中的作用是一個(gè)復(fù)雜的雙向調(diào)節(jié)過程,雖然HBx和HBsAg可通過不同途徑啟動(dòng)和誘導(dǎo)自噬發(fā)生,但HBx在體內(nèi)同時(shí)發(fā)揮出另一方面的作用,通過對(duì)ATP酶與mTOR的誘導(dǎo),導(dǎo)致溶酶體酸化和降解能力降低,兩方面共同作用下,然后體內(nèi)自噬作用是減弱的。自噬啟動(dòng)的增加及溶酶體工作能力的降低,共同導(dǎo)致了p62堆積,從而促進(jìn)病毒沾染,導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死及凋亡增加。而p62的異常堆積可活化核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2),啟動(dòng)抗氧化應(yīng)激反應(yīng),使肝細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下增加病變風(fēng)險(xiǎn)。正常細(xì)胞自噬增強(qiáng),可表現(xiàn)出阻止腫細(xì)胞發(fā)生的功能。
PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在帕金森綜合征的發(fā)病中起重要作用。PINK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,廣fan表達(dá)于各組織細(xì)胞,尤其是心臟、腦、肌肉等耗能高的qi官或組織,由581個(gè)氨基酸組成,包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域:N端的線粒體定位序列(1~84)、跨膜序列(85~110)、絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(156~509)以及C端結(jié)構(gòu)域(510~581)。Parkin是由park2基因編碼的一種蛋白,具有E3泛素-蛋白連接酶活性。Parkin蛋白包含465個(gè)氨基酸,由三部分構(gòu)成:N端的泛素樣結(jié)構(gòu)域(1~76)、C端的環(huán)指結(jié)構(gòu)域(226~465)以及鏈接區(qū)(141~225)。環(huán)指結(jié)構(gòu)域是發(fā)揮泛素蛋白連接酶活性的關(guān)鍵。明丹酚酸B能抑制饑餓心肌細(xì)胞自噬,從而發(fā)揮保護(hù)作用。蘇州自噬透射電鏡
線粒體自噬調(diào)控機(jī)制中的關(guān)鍵蛋白PINK1/Parkin、NIX/Bnip3、FUNDC1等有望成為心血管疾病分子zhiliao的靶點(diǎn)。成都自噬通路
自噬體是自噬的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)。自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),直徑一般為300~900nm,平均500nm,普通光鏡下看不到。通過透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)自噬體一直是觀察自噬現(xiàn)象常用的方法,是自噬檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)是使用較多的一類電鏡。通過發(fā)射電子束從而穿過超薄的樣品,同時(shí)與樣本相互作用,既而形成圖像。透射電鏡具有分辨率高和放大倍數(shù)高的優(yōu)點(diǎn)。其分辨率為0.1-0.2nm,放大倍數(shù)為幾萬到幾十萬倍。成都自噬通路
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