湖北細(xì)胞樣本細(xì)胞焦亡實(shí)驗(yàn)服務(wù)

來源: 發(fā)布時(shí)間:2022-04-04

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李繼喜課題組在炎性壞死(細(xì)胞焦亡)作用機(jī)理研究方面取得重要進(jìn)展。相關(guān)成果日前發(fā)表于美國《國家科學(xué)院院刊》。在此之前,科學(xué)家們尚未獲得GSDMD蛋白高分辨率三維結(jié)構(gòu)信息,從自抑制狀態(tài)到活化狀態(tài)的構(gòu)象變化也不清楚。李繼喜團(tuán)隊(duì)通過X-光晶體衍射方法解析了GSDMD-C的三維精細(xì)結(jié)構(gòu),并結(jié)合X-射線小角衍射和動(dòng)態(tài)光散射等技術(shù)分析了GSDMD的溶液結(jié)構(gòu)及物理化學(xué)性質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),GSDMD-C的***段柔性區(qū)域深入到GSDMD-N結(jié)構(gòu)域中,對(duì)GSDMD的穩(wěn)定性起著很大作用。同時(shí),基于三維結(jié)構(gòu)的定點(diǎn)突變及替換實(shí)驗(yàn)表明,該區(qū)域?qū)τ诩?xì)胞存活至關(guān)重要。表面電荷分布則表明,與C端結(jié)構(gòu)域分開后,GSDMD的N端結(jié)構(gòu)域表面暴露出來,通過正負(fù)電荷之間的相互作用,進(jìn)一步寡聚從而引起細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡兩種途徑都是通過切割GSDMD后形成N端游離的肽段。湖北細(xì)胞樣本細(xì)胞焦亡實(shí)驗(yàn)服務(wù)

炎性caspase家族蛋白——包括caspase1,4,5,11(其中4,5存在于人中),對(duì)于免疫反應(yīng)的信號(hào)傳遞起到了關(guān)鍵的作用。它們是組成"炎癥小體"(inflammasome)的重要元件,后者介導(dǎo)了多種促炎性分子(pro-IL-1beta,pro-IL-18)的表達(dá)與分泌。炎性caspase同時(shí)還參與了一類叫做"細(xì)胞焦亡"的事件的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)證明,革蘭氏陰性菌中的脂多糖(LPS)能夠激huo宿主體內(nèi)caspase1或者caspace4,5活性,也有實(shí)驗(yàn)證明caspase4,5,11能夠與LPS直接結(jié)合。這些炎性caspase的激huo能夠促進(jìn)細(xì)胞焦亡事件的發(fā)生,同時(shí)能夠激huoNLRP3炎癥小體,并引發(fā)熱休克癥狀。然而,炎性caspase究竟是如何調(diào)節(jié)這些細(xì)胞事件至今仍然有待解決。**近,來自UCSF的VishvaMDixit研究組與來自NIBS的邵峰研究組分別發(fā)現(xiàn)了一類炎性caspase的關(guān)鍵性底物:gasderminD,該蛋白的切割能夠引發(fā)細(xì)胞焦亡事件的發(fā)生。其中,Dixit等人利用正向遺傳學(xué)的手段對(duì)小鼠進(jìn)行了大規(guī)模的基因誘變,并從中篩選能夠抑制caspase11信號(hào)通路的基因。該基因名為Gsdmd,存在一個(gè)105位的異亮氨酸到賴氨酸的突變。他們發(fā)現(xiàn)這一突變體小鼠不能夠正常發(fā)生細(xì)胞焦亡,而且在轉(zhuǎn)染LPS后也不能夠正常產(chǎn)生IL-1β。上海組織樣本細(xì)胞焦亡近幾年,細(xì)胞焦亡的研究熱度迅猛上升,已成功吸引科學(xué)家們的眼球,一躍成為熱門研究領(lǐng)域。

邵峰等人則利用crispr-cas9技術(shù)通過體外的敲除試驗(yàn)鎖定了關(guān)鍵性的蛋白——gasderminD。之后,兩個(gè)組都對(duì)這一蛋白進(jìn)行小鼠基因敲除,并證明該蛋白確實(shí)參與了caspase-11依賴性的細(xì)胞焦亡。邵峰等人來證明gasderminD與細(xì)胞壞死性希望以及細(xì)胞凋亡過程均沒有必然聯(lián)系。為了進(jìn)一步探究gasderminD是如何影響細(xì)胞焦亡的發(fā)生,兩個(gè)研究組利用一系列生化實(shí)驗(yàn)證明caspase11能夠特異性地在Asp276,Gly277位點(diǎn)之間對(duì)gasderminD進(jìn)行切割,從而產(chǎn)生N端30kDa左右的蛋白以及C端22kDa左右的蛋白。其中N端的蛋白是引發(fā)細(xì)胞焦亡的活性元件,而C端則對(duì)gasderminD的切割起到了抑制的作用。作者通過將gasderminD進(jìn)行突變使其不能被正常切割,結(jié)果顯示該突變的蛋白不能引發(fā)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。邵峰等人還鑒定出了除gasderminD以外,同一家族的其它不能被caspase切割的蛋白。由于gasderminD也能夠被caspase1切割,因此邵峰等人認(rèn)為gasderminD還參與了經(jīng)典的炎癥小體引發(fā)的細(xì)胞焦亡。

Caspase-1由一個(gè)被稱為炎癥小體(Inflammasome)的復(fù)合物在感知病原信號(hào)后激huo,是細(xì)胞質(zhì)天然免疫**為重要的通路之一。邵峰實(shí)驗(yàn)室在此前的研究中曾鑒定了多個(gè)感知病原細(xì)菌的天然免疫受體蛋白(Zhaoetal.,Nature2011;Xuetal.,Nature2014),負(fù)責(zé)介導(dǎo)炎癥小體組裝和下游caspase-1的激huo。在去年的研究中(Shietal.,Nature2014),邵峰實(shí)驗(yàn)室還發(fā)現(xiàn)人的caspase-4/5和小鼠的caspase-11是細(xì)菌脂多糖(LPS,又稱為內(nèi)dusu)的胞內(nèi)受體,在結(jié)合LPS后發(fā)生寡聚而活化,誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡,在內(nèi)dusu休克和革蘭氏陰性細(xì)菌誘導(dǎo)的敗血癥中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。然而,長期以來人們對(duì)caspase-1/4/5/11活化如何引發(fā)細(xì)胞焦亡的機(jī)制則完全不清楚。在這項(xiàng)***的研究中,邵峰實(shí)驗(yàn)室的研究人員利用***的CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù),在小鼠的巨噬細(xì)胞中針對(duì)caspase-1和caspase-11介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡通路,分別進(jìn)行了全基因組范圍的遺傳篩選,以尋找那些敲除后可以抑制細(xì)胞焦亡的基因。相比于細(xì)胞凋亡,細(xì)胞焦亡發(fā)生的更快,并會(huì)伴隨著大量促炎癥因子的釋放。

細(xì)胞焦亡(pyroptosis)是一種細(xì)胞程序性死亡方式,表現(xiàn)為細(xì)胞不斷脹大直至細(xì)胞膜破裂,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的釋放進(jìn)而激huo強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。(1)細(xì)胞焦亡發(fā)生的經(jīng)典通路:在病原體、細(xì)菌等信號(hào)的刺激下,細(xì)胞內(nèi)的NLR識(shí)別這些信號(hào),通過銜接蛋白ASC與Pro-Caspase-1結(jié)合,激huoCaspase-1,活化的Caspase-1一方面切割GasderminD,形成GasderminD氮端和碳端,GasderminD氮端就會(huì)和細(xì)胞膜上的磷脂蛋白結(jié)合,形成孔洞,釋放內(nèi)容物,誘導(dǎo)焦亡發(fā)生;另一方面,活化的Caspase-1對(duì)IL-1β和IL-18的前體進(jìn)行切割,形成有活性的IL-1β和IL-18,并釋放到胞外,造成炎癥反應(yīng);(2)依賴Caspase-4、5、11的非經(jīng)典途徑:以炎性刺激因子LPS為例,沒有通過受體直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi),Caspase其它家族成員如Caspase-4、5、11被活化,活化的Caspase-4、5、11切割GasderminD,誘導(dǎo)焦亡發(fā)生;另一方面,誘導(dǎo)Caspase-1的活化,對(duì)IL-1β和IL-18的前體進(jìn)行切割,造成炎癥反應(yīng)。q-PCR/Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞焦亡相關(guān)基因或蛋白的表達(dá)水平。新疆細(xì)胞焦亡

研究表明,lncRNA在調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡中具有重要作用。湖北細(xì)胞樣本細(xì)胞焦亡實(shí)驗(yàn)服務(wù)

隨后,研究人員利用活化形式的GSDMD,GSDMA和GSDMA3蛋白通過生化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),這三種gasdermin蛋白的N端結(jié)構(gòu)域均能夠特異地結(jié)合真核細(xì)胞膜上特有的磷酸化磷脂酰肌醇(phosphoinositide)和原核細(xì)胞膜上特有的心磷脂(cardiolipin),這與gasdermin N端結(jié)構(gòu)域在真核細(xì)胞和細(xì)菌中均展示出細(xì)胞毒性相一致。通過生物化學(xué)和熒光顯微成像的細(xì)胞實(shí)驗(yàn),研究人員進(jìn)一步證實(shí),在真核細(xì)胞焦亡過程中,活化的gasdermin N端結(jié)構(gòu)域會(huì)從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上,細(xì)胞隨后出現(xiàn)體積膨脹和細(xì)胞膜向胞外吐泡的現(xiàn)象。此外,活化的gasdermin N端結(jié)構(gòu)域重組蛋白只能從真核細(xì)胞內(nèi)部破壞細(xì)胞膜,而直接加入到細(xì)胞培養(yǎng)上清中的蛋白則不能裂解細(xì)胞,這與磷酸化磷脂酰肌醇只分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)完全吻合。湖北細(xì)胞樣本細(xì)胞焦亡實(shí)驗(yàn)服務(wù)