內(nèi)源蛋白表達(dá)檢測(cè)

當(dāng)研究凋亡相關(guān)蛋白（如 caspase-3）或細(xì)菌du su（如白喉du su A 鏈）時(shí)，傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)常因蛋白毒性導(dǎo)致宿主死亡。體外蛋白表達(dá)技術(shù)通過無細(xì)胞環(huán)境規(guī)避了這一限制：在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中添加目標(biāo)基因 mRNA，4 小時(shí)內(nèi)即可獲得功能性毒性蛋白，且產(chǎn)率高達(dá) 0.5 mg/mL。2021 年斯坦福團(tuán)隊(duì)利用此技術(shù)成功表達(dá)出全長(zhǎng) 63 kDa 的 Bax 蛋白，并證實(shí)其在線粒體膜穿孔中的構(gòu)象變化。該方案不只避免了細(xì)胞毒性問題，還通過 實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)（如 FITC 標(biāo)記）量化了蛋白折疊效率，為靶向凋亡通路的抗cancer藥物篩選提供了新工具。線性化質(zhì)粒經(jīng)酚氯純化后（濃度≥0.5 μg/μL），適用于 ??T7 啟動(dòng)子介導(dǎo)的體外蛋白表達(dá)??。內(nèi)源蛋白表達(dá)檢測(cè)

體外蛋白表達(dá)正在革新現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)。以瘧疾診斷為例：將凍干的大腸桿菌裂解物、瘧原蟲 HRP2 基因 DNA 及顯色底物預(yù)裝在微流控芯片中，加入水樣后啟動(dòng) 30 分鐘體外蛋白表達(dá)反應(yīng)，生成的 HRP2 蛋白催化顯色劑變紅，靈敏度達(dá) 5 寄生蟲/μL（傳統(tǒng)試紙只 200/μL）。此方案在剛果金野外測(cè)試中顯示，陽性檢出率提升 40% 且無需冷鏈運(yùn)輸。類似技術(shù)已擴(kuò)展至COVID-19檢測(cè)——用患者鼻拭子 RNA 直接合成 Spike 蛋白，結(jié)合納米金抗體實(shí)現(xiàn) 1 小時(shí)確診。這種 “即測(cè)即表達(dá)”模式 將診斷成本降至 $0.5/次，成為資源匱乏地區(qū)的抗疫利器。大腸桿菌可溶蛋白表達(dá)檢測(cè)當(dāng)體外蛋白表達(dá)效率不足時(shí)，需檢測(cè)模板完整性并優(yōu)化啟動(dòng)子強(qiáng)度。

無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)（CFPS）的he xin組分包括細(xì)胞裂解物（如大腸桿菌、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞或小麥胚芽提取物），其中含有核糖體、tRNA、氨酰-tRNA合成酶及轉(zhuǎn)錄/翻譯因子（如啟動(dòng)/延伸/終止因子）。此外，系統(tǒng)需補(bǔ)充能量再生系統(tǒng)（如ATP、磷酸肌酸與肌酸激酶）以維持反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，以及底物（氨基酸、核苷酸）和輔因子（Mg2?、K?等）以支持蛋白質(zhì)合成。例如，大腸桿菌S30提取物常通過敲除核酸酶和蛋白酶來提升蛋白穩(wěn)定性。英國nuclera高通量微流控蛋白表達(dá)篩選系統(tǒng)可支持助力無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)，如想更多關(guān)于該產(chǎn)品的信息，歡迎咨詢官方代理商上海曼博生物！

無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)（CFPS）在毒性蛋白和膜蛋白的合成中展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)細(xì)胞系統(tǒng)難以表達(dá)具有細(xì)胞毒性的蛋白（如溶菌酶、限制性內(nèi)切酶），而無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)通過體外開放環(huán)境規(guī)避了宿主細(xì)胞存活限制，可高效合成活性毒蛋白，例如珀羅汀生物成功表達(dá)的BamHI內(nèi)切酶，其Minimun活性濃度只需0.001μg/μL。此外，無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)通過添加表面活性劑或脂質(zhì)體模擬膜環(huán)境，實(shí)現(xiàn)了全長(zhǎng)跨膜蛋白（如CLDN18.1）的可溶表達(dá)，純度達(dá)80%以上，為藥物靶點(diǎn)開發(fā)提供了關(guān)鍵工具。通過微型化??體外蛋白表達(dá)??系統(tǒng)，24小時(shí)內(nèi)測(cè)試了50種激酶抑制劑的效價(jià)。

相較于傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，體外蛋白表達(dá)的he xin優(yōu)勢(shì)在于：時(shí)間效率ge min性提升： 省略細(xì)胞培養(yǎng)與基因整合步驟，目標(biāo)蛋白可在2-8小時(shí)內(nèi)合成；開放體系可編程性： 直接添加非天然氨基酸、同位素標(biāo)記底物或熒光基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物化學(xué)性質(zhì)的準(zhǔn)確調(diào)控；毒性蛋白表達(dá)可行性： 無細(xì)胞環(huán)境避免毒性蛋白導(dǎo)致的宿主死亡，為凋亡因子等特殊分子研究提供可能；微型化兼容性： 反應(yīng)體積可縮小至納升級(jí)，適配高通量篩選需求。這些特性使體外蛋白表達(dá)成為 功能蛋白快速驗(yàn)證的推薦平臺(tái)，尤其在需平行測(cè)試多突變體的場(chǎng)景中具明顯優(yōu)勢(shì)。從模板添加到獲得功能性體外表達(dá)蛋白只需6小時(shí)??，而HEK293系統(tǒng)需兩周。桿狀病毒蛋白表達(dá)行業(yè)動(dòng)態(tài)

大腸桿菌裂解物添加含T7啟動(dòng)子的線性DNA后，利用其??高密度核糖體??快速啟動(dòng)蛋白表達(dá)。內(nèi)源蛋白表達(dá)檢測(cè)

相較于原核表達(dá)體系，真核體外蛋白表達(dá)的he xin優(yōu)勢(shì)在于具備部分翻譯后修飾能力，但 關(guān)鍵修飾途徑仍存在明顯局限。在缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的情況下，糖基化修飾通常終止于高甘露糖型（Man?GlcNAc?）階段，無法合成復(fù)雜雙觸角唾液酸化糖鏈。這一缺陷直接影響zhi liao性抗體的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）效應(yīng)。同時(shí)，裂解物中二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）與分子伴侶（如BiP）的活性不足，導(dǎo)致含多對(duì)二硫鍵的蛋白錯(cuò)誤折疊率升高40%-60%。為克服此瓶頸，需在裂解物中外源性添加重組糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體（如GnT-I/GnT-II/FUT8）以重構(gòu)修飾途徑，并通過優(yōu)化氧化還原電勢(shì)（Eh=-230 mV至-280 mV）改善二硫鍵形成效率。體外蛋白表達(dá)的這些修飾缺陷是目前制約其應(yīng)用于功能性糖蛋白生產(chǎn)的主要因素。內(nèi)源蛋白表達(dá)檢測(cè)