美國(guó)investigator雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么

來源: 發(fā)布時(shí)間:2025-07-09

而配合了雙光子激發(fā)技術(shù),激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么,什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢?在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí),經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后,電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子(P=h/λ)。利用這個(gè)原理,便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光,通過物鏡匯聚,由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的,所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā),產(chǎn)生熒光,該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡,從而被光探頭接收,從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞成像,雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。美國(guó)investigator雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么

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和很多偉大的科學(xué)發(fā)明一樣,雙光子顯微鏡的出現(xiàn)也有一點(diǎn)偶然,但正是那瞬間的靈感為生物科學(xué)尤其是神經(jīng)科學(xué)帶來了一種**性的成像技術(shù):雙光子激發(fā)熒光顯微鏡。1990年初,當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時(shí),他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書,從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強(qiáng)光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時(shí),Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強(qiáng)大的紫外激光器和光學(xué)元件,于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外,換言之,與其通過一個(gè)紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子,通過兩個(gè)雙倍波長(zhǎng)的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實(shí)驗(yàn)。借了一套染料飛秒激光器,Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個(gè)小時(shí)就完成了實(shí)驗(yàn)搭建,采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天,于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。雙光子顯微鏡價(jià)位雙光子顯微鏡的應(yīng)用中,該如何選擇以及更好的使用PMT。

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雙光子顯微鏡(2PM)可以對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進(jìn)行亞細(xì)胞分辨率的成像,從而測(cè)量不透明腦深部的活動(dòng)。成像膜的電壓變化可以直接反映神經(jīng)元的活動(dòng),但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對(duì)于常規(guī)的2PM來說太快了。目前,電壓成像主要由寬視場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn),但其空間分辨率較差,且只能在淺深度成像。因此,為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化,需要將成像速率提高2PM。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發(fā)出的光,這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時(shí)間延遲的聚焦陣列。然后,該模塊被集成到一個(gè)帶有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中,如圖2所示。光源是重復(fù)頻率為1MHz的920nm激光器。FACED模塊可以產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn),脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像。虛光源越遠(yuǎn),物鏡處的光束尺寸越大,焦點(diǎn)越小。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡,從而在X軸上產(chǎn)生0.82m和0.35m的橫向分辨率。

雙光子熒光顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在光子密度較高的情況下,熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光子,經(jīng)過短暫的所謂激發(fā)態(tài)壽命后,發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子;效果和用波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子激發(fā)熒光分子是一樣的。雙(多)光子成像的優(yōu)點(diǎn)是具有更深的組織穿透深度,紅外光可以在平面上探測(cè)到極限為1mm的組織區(qū)域;因?yàn)樾盘?hào)背景比高,所以具有更高的對(duì)比度;由于激發(fā)體積小,具有定點(diǎn)激發(fā)、光毒性小的特點(diǎn);激發(fā)波長(zhǎng)由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),更加安全。雙光子顯微鏡中,同樣每個(gè)時(shí)刻只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號(hào)被探測(cè),并且連焦平面外的熒光信號(hào)也不會(huì)有。

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配合了雙光子激發(fā)技術(shù),激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢?在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí),經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后,電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子(P=h/λ)。利用這個(gè)原理,便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光,通過物鏡匯聚,由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的,所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā),產(chǎn)生熒光,該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡,被光探頭接收,從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?美國(guó)布魯克雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么

雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用。美國(guó)investigator雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么

通過并行化不同激光波長(zhǎng)的激光掃描,研究人員增加了在相同時(shí)間內(nèi)可以成像的體積,同時(shí)保持了高的時(shí)間和空間分辨率。研究人員通過引入兩種不同波長(zhǎng)的鈣信號(hào)熒光探針,將神經(jīng)元群體的活動(dòng)標(biāo)記為兩種不同的顏色,同時(shí)激發(fā)兩種不同波長(zhǎng)的探針,從而實(shí)現(xiàn)了兩種顏色的并行數(shù)據(jù)記錄。為了實(shí)現(xiàn)三維空間成像,研究人員還在兩個(gè)激光束上配置了快速變焦系統(tǒng),即一個(gè)電透鏡和一個(gè)空間光調(diào)制器。因此,可以以10Hz的速度同時(shí)記錄10個(gè)500微米和500微米的平面,覆蓋600微米的深度,覆蓋大腦皮層第二層到第五層的結(jié)構(gòu),體積內(nèi)可以記錄2000多個(gè)神經(jīng)元。美國(guó)investigator雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么