細胞轉染簡介:轉染,是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入,轉染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因屬于通過物理方法將基因導入細胞的范例;化學介導方法很多,如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術;生物介導方法,有較為原始的原生質體轉染,和現(xiàn)在比較多見的各種細菌介導的轉染技術。對大多數(shù)細胞而言,均需要在轉染當天或前現(xiàn)在鋪板,第二天上午進行轉染。重慶細胞高效轉染試劑報價
細胞轉染實驗簡介實驗步驟:1、細胞傳代(1)試驗準備:200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌),酒精棉球,廢液缸,試管架,微量移液器,記號筆,培養(yǎng)皿,離心管。(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基,用1ml的PBS溶液洗滌兩次。(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液,消化1分鐘(37。C,5%CO2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁,觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應。(5)用頭多次吹吸,使細胞完全分散開。(6)將培養(yǎng)液裝入離心管中,1000rpm離心5min。(7)用培養(yǎng)液重懸細胞,細胞計數(shù)后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。(8)將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中,混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中,使其均勻分布。(9)將培養(yǎng)皿轉入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),第二天轉染。青島正規(guī)細胞高效轉染試劑生產(chǎn)廠家再通過融合或細胞內吞進入細胞。
細胞轉染的注意事項:細胞狀態(tài)這點非常重要,不要急于求成,一定要讓細胞處于較佳的生長狀態(tài)再做。有文獻說傳代不要超過17代。細胞復蘇后的3代左右時細胞狀態(tài)較好,不要用傳了很多代的細胞去做,細胞的形態(tài)都會發(fā)生變化。大多數(shù)已建立的細胞系都是非整倍體,原代培養(yǎng)包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變,總染色體重組或基因調控變化等而演化。這會導致和轉染相關的細胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化,融化一管新鮮的細胞可能會恢復原先的轉染活性。因此,如果觀察到轉染效率降低,可以試著轉染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復較佳結果?;蛘?,幾種來源于經(jīng)篩選,轉染效率較高細胞亞系的細胞系現(xiàn)在有售。
細胞電轉染實驗的幾點建議:1.電場強度要合適合適的電場強度對于電轉染實驗非常重要,電場強度不能過高,過高會增加細胞的死亡率;也不能過低,過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細胞系具有不同的較佳場強值,實驗前應測定所轉染細胞系的較佳電場強度。2.細胞狀態(tài)要好用于電轉的細胞一般選取處于對數(shù)生長期的細胞(15代以內,傳代后2d)。因為處于對數(shù)生長期的細胞分裂旺盛,表面結構致密比穩(wěn)定期的細胞差,電轉后,細胞膜的恢復能力強,而且處于有絲分裂期的細胞更容易接受外源DNA可以使用一些營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基,或者在轉染培養(yǎng)基中使用血清。
細胞轉染效率低下的幾個大坑:1.試劑過期有時候轉染效率低下,還要考慮會不會存在試劑過期的情況。毛博當年做轉染整整半年,百思不得其解。較后發(fā)現(xiàn),原來是Lipofectamine2000過期了。換了之后,立馬成功。根據(jù)我的經(jīng)驗,盡量使用開封半年內的,因為過了半年后,就算沒有過失效期,但是細胞毒性較大增加,而轉染效率卻較大下降。千萬不要為了省錢,影響實驗進度哈。2.未加血清轉染后未及時加入血清,會導致細胞大量死亡。一般要在轉染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基。根據(jù)毛博的經(jīng)驗,其實也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個時候,較好不要換液,不要打擾細胞,讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清。過早的話,會引起未轉染的細胞瘋狂生長。建議選擇50%~80%區(qū)間密度進行細胞轉染。南京昆明細胞高效轉染試劑
代細胞和傳代次數(shù)多的細胞都不是較佳選擇。重慶細胞高效轉染試劑報價
細胞轉染的注意事項:轉染是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。分為物理介導方法:電穿孔法、顯微注射和基因;化學介導方法:如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術;生物介導方法:有較為原始的原生質體轉染,和現(xiàn)在比較多見的各種細菌介導的轉染技術。理想細胞轉染方法,應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點。細菌介導的轉染技術,是目前轉染效率較高的方法,同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是細菌轉染方法的準備程序復雜,常常對細胞類型有很強的選擇性,在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉染方法,則各有其特點。需要指出的一點,無論采用哪種轉染技術,要獲得較優(yōu)的轉染結果,可能都需要對轉染條件進行優(yōu)化。影響轉染效率的因素很多,從細胞類型、細胞培養(yǎng)條件和細胞生長狀態(tài)到轉染方法的操作細節(jié)。重慶細胞高效轉染試劑報價