熒光素酶D-熒光素鉀鹽應(yīng)用

    具體實驗流程：注：該操作流程通常用來檢測轉(zhuǎn)染了螢火蟲熒光素酶基因的真核細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)的活性，不適用于對細(xì)菌熒光素酶進(jìn)行檢測。1．實驗***天，消化并接種細(xì)胞（根據(jù)具體實驗選擇合適的細(xì)胞）于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于5％CO2、飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。2．等細(xì)胞密度達(dá)到70％時用Luciferase報告基因質(zhì)粒、LacZ的表達(dá)質(zhì)粒及其它質(zhì)粒（根據(jù)具體實驗確定）共轉(zhuǎn)染細(xì)胞（根據(jù)具體實驗選擇轉(zhuǎn)染方法，如磷酸鈣沉淀法、PEI、lipofectamine2000等均可）。3．轉(zhuǎn)染24－36h后，吸取培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS（無鈣和鎂離子）洗滌細(xì)胞。注：熒光酶的酶促反應(yīng)會被痕量的鈣所抑制，故用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在收集細(xì)胞前應(yīng)充分洗滌除去含鈣介質(zhì)。4．在每個培養(yǎng)皿中加入350μl預(yù)冷的harvestbuffer,于4℃或冰上放置10min裂解細(xì)胞。5．在細(xì)胞裂解期間，準(zhǔn)備足量的ml微量離心管，將ATPbuffer與luciferinbuffer以1：，每管100μl。6．依次取等體積的細(xì)胞裂解液（100μl）至步驟5中的離心管中，迅速混勻，在發(fā)光儀（Luminometer）上讀取吸光值。注：發(fā)光反應(yīng)會迅速衰減，將細(xì)胞裂解液加入反應(yīng)液后5s內(nèi)必須讀取吸光值。7．確保以相同操作手法讀取全部樣品吸光值后。做D-熒光素鉀鹽測試找哪家公司？熒光素酶D-熒光素鉀鹽應(yīng)用

    或分裝于-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。2）用預(yù)熱好的組織培養(yǎng)基將儲存液稀釋至mg/mL的工作液濃度。3）去除細(xì)胞培養(yǎng)基。4）待圖像分析前，向細(xì)胞內(nèi)添加熒光素工作液，37℃孵育5-10min，然后進(jìn)行圖像分析。2.***成像分析1）用無菌的DPBS(w/oMg2+、Ca2+)配制15mg/mL的熒光素的儲存液，混勻。2）用μm濾膜過濾除菌。立即使用，或分裝于-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。3）腹腔注射（.），按照150mg/kg的熒光素/體重濃度進(jìn)行注射。4）注射入體內(nèi)10-15min（待光信號達(dá)到更強(qiáng)穩(wěn)定平臺期）后進(jìn)行成像分析。注：建議對每只動物模型都需要建立熒光素酶動力學(xué)曲線，從而確定更高信號檢測時間和信號平臺期。注意事項1）本品（fireflyluciferin）和甲蟲熒光素（beetleluciferin）只只是不同公司在命名上的差異,都是指化合物(S)-2-(6-Hydroxy-2-benzothiazolyl)-2-thiazoline-4-carboxylicacid。2）注射方式、動物類型以及體重等都會影響信號的發(fā)射，因此建議每次實驗都要做熒光素酶動力學(xué)曲線，確定更佳信號平臺期和更佳的檢測時間。3）如果要進(jìn)行ATP的檢測，盡量避免外源ATP的污染，如操作時戴手套并使用ATP-free的實驗耗材，在進(jìn)行熒光素的溶解時應(yīng)使用ATP-free無菌水。蘇州螢火蟲熒光素酶D-熒光素鉀鹽哪家好D-熒光素有時候也叫游離酸。

    可以以方便的96孔和384孔微量滴定板形式進(jìn)行半衰期為一小時的“輝光型”信號在大量檢測板之間提供一致的信號與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞生長培養(yǎng)基兼容海腎熒光素酶海腎螢光素酶是一種從海桑（Renillareniformis）分離的36kDa蛋白。與螢火蟲熒光素酶相比，海腎熒光素酶的底物和輔因子要求不同。海腎熒光素酶在氧氣存在下使用腔腸素，產(chǎn)生480nm的藍(lán)光。與螢火蟲螢光素酶類似，海腎螢光素酶因其底物要求和光輸出方面的差異而可用于雙重報告檢測。Amplite?海腎熒光素酶報告基因測定Amplite?Renilla螢光素酶報告基因檢測試劑盒（#AAT-12535）提供了一種快速，靈敏的方法，可以使用專有的發(fā)光配方在基于細(xì)胞的檢測中檢海腎螢光素酶的活性，與海腎螢光素酶相互作用后，該試劑產(chǎn)生具有強(qiáng)光的產(chǎn)物。Amplite?海腎熒光素酶報告基因檢測試劑盒特點：該測定法與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞生長培養(yǎng)基兼容該試劑盒可以測量野生型和合成hRluc基因的原始表達(dá)或基因表達(dá)每個試劑盒均包含可以方便96孔和384孔板檢測所必不可少的組分各類螢光素酶底物，輔因子和物理特性：近幾十年來，腺苷三磷酸(ATP)生物發(fā)光技術(shù)得到了很大的發(fā)展，已經(jīng)在細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性和生物量計數(shù)等方面廣泛應(yīng)用。

    而發(fā)出不同顏色的熒光。螢火蟲有2000多種，而叩甲總科（包括螢火蟲、叩頭蟲和相關(guān)昆蟲）則有更多，因此它們的熒光素酶對于分子系統(tǒng)學(xué)研究很有用。目前研究得更透徹的熒光素酶是來自Photinini族螢火蟲中的北美螢火蟲（Photinuspyralis）。熒光素酶報告基因（Luc）是指以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。熒光素酶是能夠催化不同底物氧化發(fā)光的一類酶，哺乳細(xì)胞無內(nèi)源性熒光素酶。更常用的熒光素酶有細(xì)菌熒光素酶、螢火蟲熒光素酶和Renilla熒光素酶。細(xì)菌熒光素酶對熱敏感，因此在哺乳細(xì)胞的應(yīng)用中受到限制。螢火蟲熒光素酶靈敏度高，檢測線性范圍寬達(dá)7～8個數(shù)量級，是更常用于哺乳細(xì)胞的報道基因，用熒光比色計即可檢測酶活性，因而適用于高通量篩選。隨著具有膜通透性和光裂解作用的螢火蟲熒光素酶的應(yīng)用，無需裂解細(xì)胞即可檢測酶活性。Renilla熒光素酶催化腸腔（coelenterazine）氧化，產(chǎn)物可透過生物膜，可能是更適用于活細(xì)胞的報告分子。將熒光素酶報告基因載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。D-熒光素鉀鹽測試方法是體外生物發(fā)光檢測。

    可用于需要低檢測限的測定具有用于研究基因調(diào)控和功能的快速，簡單且均一的生物發(fā)光測定法與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞生長培養(yǎng)基的使用兼容高斯熒光素酶近年來，其他熒光素酶（例如高斯熒光素酶）的使用有所增加，因為這些報告基因較小，并且不需要ATP的存在。高斯熒光素酶是一種20kD的蛋白質(zhì)，可通過氧氣催化腔腸素氧化，產(chǎn)生光。來自于海洋足類高斯氏菌的生物發(fā)光酶在表達(dá)后可有效地從哺乳動物細(xì)胞中分泌出來。Amplite?高斯熒光素酶報告基因檢測試劑盒使用專有的發(fā)光配方來定量細(xì)胞培養(yǎng)基中的熒光素酶活性。當(dāng)該試劑與高斯熒光素酶相互作用時，產(chǎn)***光產(chǎn)物，該發(fā)光產(chǎn)物提供強(qiáng)發(fā)光。Amplite高斯熒光素酶報告基因測定試劑盒特點：提供了與HTS液體處理儀器兼容的所有基本組件它們具有高靈敏度，可以以方便的96孔和384孔微量滴定板形式進(jìn)行半衰期為一小時的“輝光型”信號在大量檢測板之間提供一致的信號與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞生長培養(yǎng)基兼容海腎熒光素酶海腎螢光素酶是一種從海桑（Renillareniformis）分離的36kDa蛋白。與螢火蟲熒光素酶相比，海腎熒光素酶的底物和輔因子要求不同。海腎熒光素酶在氧氣存在下使用腔腸素，產(chǎn)生480nm的藍(lán)光。與螢火蟲螢光素酶類似。南京D-熒光素鉀鹽測試公司有哪幾家。蘇州螢火蟲熒光素酶D-熒光素鉀鹽哪家好

D-熒光素鹽也算是鈉鹽和鉀鹽。熒光素酶D-熒光素鉀鹽應(yīng)用

    8．取剩余裂解液測定LacZ的活性，其讀數(shù)作為內(nèi)標(biāo)用以矯正熒光素酶的讀數(shù)。9.用矯正后的讀數(shù)作圖，分析數(shù)據(jù)。注：熒光素見光易氧化，已稀釋未用的熒光素應(yīng)丟棄。注意事項：1．熒光素酶檢測試劑需在15-25℃條件下預(yù)平衡后再進(jìn)行反應(yīng)，而后依據(jù)具體條件進(jìn)行自動或手動檢測。當(dāng)用液閃計數(shù)儀時，加入熒光素酶檢測試劑后立即輕輕混勻。2．如果細(xì)胞裂解后不能立即對提取物進(jìn)行檢測，樣品可以在冰上保存大約5h，在-70℃可保存數(shù)月。不要反復(fù)凍融以避免酶活性的降低。3．利用上述方法檢測冷的樣品時，其信號強(qiáng)度將下降5-15%。4．在熒光素酶活性較高的情況下，導(dǎo)致信號超出線性范圍（信號溢出）可用裂解液將樣品進(jìn)行稀釋。5．不要儲存稀釋過的樣品。如果必須保存，要在稀釋的樣品中加入BSA至終濃度為，這樣可以保持樣品的穩(wěn)定性。6．一些熒光儀在進(jìn)行檢測前需要1-2s的穩(wěn)定，因此建議在開機(jī)后過一段時間再進(jìn)行檢測操作。熒光素酶報告基因檢測主要有哪些用途？a.啟動子結(jié)構(gòu)分析，將啟動子區(qū)域序列（通常2k左右）進(jìn)行分段截短，或?qū)μ囟ㄎ稽c進(jìn)行突變，再分別構(gòu)建入luciferase報告載體，檢測其啟動子活性。b.啟動子SNP分析，一些基因的啟動子區(qū)域存在單核苷酸多態(tài)性。熒光素酶D-熒光素鉀鹽應(yīng)用

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