鹽城凍存細(xì)胞凍存液配制比例

    非商業(yè)轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明出處。注意事項(xiàng)：錯(cuò)誤的時(shí)機(jī)：細(xì)胞狀態(tài)不好（長(zhǎng)的太過了，培養(yǎng)液已經(jīng)很黃；細(xì)胞可疑污染；細(xì)胞已經(jīng)開始凋亡或崩解；連續(xù)培養(yǎng)超過二個(gè)月，細(xì)胞性狀已有改變改變）。解決：**佳時(shí)機(jī)：細(xì)胞增殖旺盛，情況穩(wěn)定，試驗(yàn)效果良好，復(fù)蘇后兩周內(nèi)。2.細(xì)胞太少：凍存時(shí)細(xì)胞濃度低于1-5×1000,000/ml。（復(fù)蘇很難成功）。解決：離心后調(diào)整細(xì)胞濃度。（不要重新洗細(xì)胞）。3.蓋子不緊：凍存管的蓋子一定要擰緊，否則復(fù)蘇水浴時(shí)會(huì)滲水，造成污染。解決：選擇原配的管子和蓋子（不同牌子/型號(hào)的顏色會(huì)有差別）。4.單薄的凍存盒：放在－80度的凍存盒，壁太薄，細(xì)胞在被迅速降溫。解決：選擇厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（凍存的原則：緩降?。悍旁冢?0度冰箱的時(shí)間超過半年。（冰箱的溫度難以恒定:開門/關(guān)門，電壓不穩(wěn)等）解決：盡快轉(zhuǎn)入液氮。6.液氮不足：液面不能漫過所有細(xì)胞解決：定期測(cè)量液氮儲(chǔ)備，保證細(xì)胞全部浸在液面下。7.取錯(cuò)細(xì)胞：找不到/拿錯(cuò)凍存管。解決：每支凍存管都標(biāo)上細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間，并記錄在冊(cè)。二、細(xì)胞復(fù)蘇：方法：從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子。無血清細(xì)胞凍存液測(cè)試需要哪些必備條件？鹽城凍存細(xì)胞凍存液配制比例

    細(xì)胞凍存技術(shù)作為一種保存細(xì)胞的有效方法，在生物學(xué)領(lǐng)域已有深入***的應(yīng)用。因?yàn)檎Ｇ闆r下，直接冷凍細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生冰晶對(duì)細(xì)胞造成傷害，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。所以需要通過添加冷凍保護(hù)劑配制細(xì)胞凍存液，來保護(hù)細(xì)胞。凍存保護(hù)劑根據(jù)其是否穿透細(xì)胞膜可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性冷凍保護(hù)劑多是一些小分子物質(zhì)，可以透過細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞內(nèi)。包括二甲基亞砜(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙醇、丙醇、和甲酰胺等。這類保護(hù)劑能夠在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，穿過細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分也不會(huì)過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水皺縮。非滲透性冷凍保護(hù)劑一般是些大分子物質(zhì)，不能滲透到細(xì)胞內(nèi)。該類保護(hù)劑主要包括聚yi烯吡ge烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及***等。其保護(hù)機(jī)制的假設(shè)很多，其中一種可能是，聚yi烯吡ge烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中的水分子相結(jié)合，降低溶液中自由水的含量。使冰點(diǎn)降低。減少冰晶的形成；同時(shí)，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷。南京細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞凍存液配方無血清細(xì)胞凍存液是即用型細(xì)胞凍存液。

    凍存成功的兩大必要條件細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)按照標(biāo)準(zhǔn)凍存程序操作為什凍存細(xì)胞需要加入保護(hù)劑在不附加任何保護(hù)劑下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在負(fù)130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備凍存管、15毫升離心管、移液管、移液槍、qiang頭等放入無菌超凈工作臺(tái)，以紫外線照射30分鐘。采用通風(fēng)機(jī)通風(fēng)3分鐘。以75%酒精擦拭操作臺(tái)和雙手。準(zhǔn)備好冰盒。將離心機(jī)調(diào)節(jié)至800轉(zhuǎn)，3分鐘。水浴箱調(diào)節(jié)至37度恒溫。取細(xì)胞完全培養(yǎng)基、DMSO、胰蛋白酶等，放于水浴箱中預(yù)熱。首先消毒雙手和超凈臺(tái)。取約10毫升細(xì)胞完全培養(yǎng)基放于15毫升離心管中。配置細(xì)胞凍存液：凍存液應(yīng)該提前配制，置于室溫備用，防止臨時(shí)配制產(chǎn)生的熱量損傷細(xì)胞，按無血清培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1的比例配置細(xì)胞凍存液，其中加大凍存液中血清的比例對(duì)于保存某些脆弱的干細(xì)胞以及一些比較珍貴的細(xì)胞很有好處的。按比例加好凍存液組分后，輕輕吸打混勻，置于室溫下待用。

    在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞凍存是**關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，尤其在細(xì)胞***、細(xì)胞存儲(chǔ)中對(duì)細(xì)胞凍存更有特殊要求，下面就根據(jù)降溫速度以及凍存液組分對(duì)細(xì)胞凍存做詳細(xì)介紹。根據(jù)降溫速度區(qū)分，細(xì)胞凍存可以分為程序降溫凍存與非程序降溫凍存。根據(jù)凍存方式不同可以分為慢速凍存（程序降溫法）與快速凍存（非程序降溫法）。程序降溫凍存技術(shù)要點(diǎn)是慢凍，標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2/℃min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/min。之前，常用的傳統(tǒng)方法是將凍存管置于4℃30分鐘--->-20℃60分鐘--->-80℃過夜--->液氮罐。不過，由于步驟較多，間隔時(shí)間又長(zhǎng)，很容易遺忘。之后，人們也開始使用程序降溫盒。將凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80℃冰箱。以1℃/min的速度進(jìn)行降溫?？焖賰龃婕床恍枰?jīng)過梯度降溫，直接將細(xì)胞放入-80℃冰箱24h，后轉(zhuǎn)入液氮長(zhǎng)期凍存?？焖賰龃婧?jiǎn)化了凍存步驟，同時(shí)不需要使用梯度凍存盒。不同的凍存方法**了不同的凍存體系，程序降溫法使用的凍存液主要配方為培養(yǎng)基、血清、DMSO。血清大多采用牛源，同時(shí)血清中未知成分和病毒等***物質(zhì)會(huì)給凍存帶來影響與風(fēng)險(xiǎn)，該方法科研上***使用，并延續(xù)至今。無血清細(xì)胞凍存液研究領(lǐng)域。

    并上下振蕩數(shù)次混勻。備注：為了盡量減少污染，未使用完的細(xì)胞凍存液**好凍回-20℃，反復(fù)凍融不影響使用效果。2.用細(xì)胞消化液將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞消化成單細(xì)胞，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)器或血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度。備注：懸浮細(xì)胞不需要消化但仍需要細(xì)胞計(jì)數(shù)，不易消化成單細(xì)胞的各種293細(xì)胞等**好使用含有EDTA的胰酶進(jìn)行消化。3.用低速離心沉淀細(xì)胞，棄去上清。備注：通常2000~3000rpm離心5~10min即可。4.用適量細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞。備注：細(xì)胞濃度可根據(jù)情況調(diào)整為1~5×106/ml，通常為3×106/ml左右。5.按每管1ml分裝到細(xì)胞凍存管中。6.直接放入-70℃冰箱中凍存。備注：無需程序降溫盒或從4℃到-20℃到-70℃冰箱的繁瑣程序降溫。。備注：對(duì)于不同細(xì)胞，使用本細(xì)胞凍存液也可在-70℃冰箱中保存數(shù)周甚至數(shù)月，但建議**好盡快轉(zhuǎn)入液氮中保存。8.復(fù)蘇方法同常規(guī)細(xì)胞凍存液。備注：對(duì)于大多數(shù)對(duì)DMSO不敏感的細(xì)胞，復(fù)蘇時(shí)甚至傳代前無需去除細(xì)胞凍存液，實(shí)際上本細(xì)胞凍存液中某些成分具有一定的促細(xì)胞生長(zhǎng)特性。可見，Quick-Freezing-M無血清細(xì)胞凍存液相對(duì)于含血清細(xì)胞凍存液的優(yōu)勢(shì)有：1.即用型，無需現(xiàn)配，直接將細(xì)胞懸浮于凍存液中即可2.通用型。南京做無血清細(xì)胞凍存液公司有哪幾家。徐州懸浮細(xì)胞凍存液配制比例

無血清細(xì)胞凍存液儲(chǔ)存需要滿足哪些條件？鹽城凍存細(xì)胞凍存液配制比例

    其中DMSO的含量是10%，血清的含量是10%，統(tǒng)稱為含血清細(xì)胞凍存液。含血清細(xì)胞凍存液的一般的凍存方法是梯度降溫凍存法，如先將冷凍管置于4℃冰箱10分鐘，然后移至-20℃冰箱30分鐘，再移至-80℃冰箱保存16-18個(gè)小時(shí)（或隔夜），后來才移至液氮罐中進(jìn)行長(zhǎng)期的儲(chǔ)存。（其中需要注意的是-20℃條件下不可超過1個(gè)小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量的死亡。）可見，含血清細(xì)胞凍存液凍存細(xì)胞時(shí)遇到的問題：1.凍存細(xì)胞時(shí)需現(xiàn)配凍存液(如購(gòu)買市面上通用的含血清細(xì)胞凍存液，此步可省略)2.需要程序降溫（4℃→-20℃→-80℃→液氮），步驟繁瑣，耗時(shí)耗力3.含血清，細(xì)胞污染(病毒、霉菌和支原體等)的風(fēng)險(xiǎn)更高4.血清批次、品質(zhì)間差異導(dǎo)致凍存液的批次間差異5.需液氮凍存，且不能原位（如孔板）凍存Cellregen無血清細(xì)胞凍存液是不含血清和動(dòng)物源成分，含DMSO、糖類、氨基酸等成分的一款通用型細(xì)胞凍存液。Cellregen無血清細(xì)胞凍存液的凍存方法是：將細(xì)胞凍存懸液（凍存管或孔板）直接放置-80℃冰箱長(zhǎng)期保存。可見，Cellregen無血清細(xì)胞凍存液相對(duì)于含血清細(xì)胞凍存液的優(yōu)勢(shì)有：1.即用型，無需現(xiàn)配，直接將細(xì)胞懸浮于凍存液中即可2.通用型。鹽城凍存細(xì)胞凍存液配制比例

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