浙江GFP-LC3單熒光自噬

自噬在病變發(fā)生的不同階段扮演了完全不同的角色。作為正常細(xì)胞生命活動(dòng)所必需的一種過程，自噬水平低下可導(dǎo)致細(xì)胞病變。例如，在胃病和結(jié)腸病等病變細(xì)胞中，經(jīng)?？捎^察到和Beclin-1密切相關(guān)的蛋白BIF-1突變或缺失，而Beclin-1是自噬信號(hào)通路中的一種關(guān)鍵蛋白。在小鼠模型中，敲除自噬相關(guān)蛋白Atg7和Atg5可誘發(fā)肝病。進(jìn)一步研究表明，自噬可以清理受損線粒體，從而避免受損線粒體產(chǎn)生大量活性氧，而活性氧可以對(duì)DNA等遺傳物質(zhì)造成損傷進(jìn)而致病。從這個(gè)角度來說，在一些病變發(fā)生的早期，促進(jìn)自噬可能是一條可行的抗病變途徑。而在自噬的情況下，熒光顯微鏡下GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以斑點(diǎn)的形式表現(xiàn)出來(LC3B dots or punctae)。浙江GFP-LC3單熒光自噬

自噬的功能：(1)饑餓應(yīng)答時(shí)的作用,在不同的部位如肝臟或在培養(yǎng)細(xì)胞中,氨基酸的匱乏會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自體吞噬,由自體吞噬分解大分子,產(chǎn)生在分解代謝和合成代謝過程中所必須的中間代謝物。(2)在細(xì)胞正常活動(dòng)中的作用,如在動(dòng)物的異常發(fā)育、老化和分化過程中,自體吞噬負(fù)責(zé)降解正常的蛋白以重新組建細(xì)胞。盡管通常人們認(rèn)為自體吞噬不具有選擇性,但是在某些病理和壓力條件下,通過自體吞噬能選擇性地隔離某些細(xì)胞器,如線粒體、過氧化物酶體等。(3)在某些組織中的特定功能,如黑質(zhì)的塞梅林神經(jīng)節(jié)中,多巴胺能神經(jīng)元中的神經(jīng)黑色素的合成就需要把細(xì)胞質(zhì)中的多巴胺醌用AV包被隔離起來。自噬是一種通過溶酶體在細(xì)胞內(nèi)部降解功能失調(diào)的細(xì)胞組分的過程。浙江GFP-LC3單熒光自噬疫苗是預(yù)防肝病發(fā)生比較經(jīng)濟(jì)有效的方式，疫苗都與自噬關(guān)系密切。

防己諾林堿是中藥粉防己的有效成分之一，1×10-3～1×103 mmol/L的防己諾林堿可激huop53/sestrin2/AMPK通路，誘導(dǎo)HepG2和PLC/PRF/5細(xì)胞自噬性死亡，但不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；抑制AMPK通路和干擾Atg5基因后，可削弱防己諾林堿的上述作用，提示防己諾林堿誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的作用機(jī)制可能與激huop53/sestrin2/AMPK通路相關(guān)?；鹇槿实某煞执髆a酰B也可通過抑制Akt/mTOR通路誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬性死亡。另外，姜黃素和阿霉素聯(lián)合用藥后，可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬，上調(diào)LC3-II的量，提高LC3標(biāo)記的自體吞噬體和自噬性溶酶體的表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)凋亡，也提示聯(lián)合用藥防治肝ai的有效性。

選擇性自噬是真核生物體內(nèi)清理蛋白、受損細(xì)胞器和外源微生物的基礎(chǔ)生理過程。而蛋白的翻譯后修飾，特別是泛素化修飾能夠作為選擇性自噬中的底物識(shí)別的重要信號(hào)。崔雋教授課題組發(fā)現(xiàn)選擇性自噬參與調(diào)控非經(jīng)典NF-kB信號(hào)通路的重要過程。選擇性自噬中的貨物受體p62通過識(shí)別p52/p100的N端上的K63泛素化鏈進(jìn)而促使p52/p100發(fā)生自噬降解，阻止非經(jīng)典NF-kB信號(hào)通路。有趣的是，已有報(bào)道認(rèn)為p100C端的K48泛素化鏈?zhǔn)堑鞍酌阁w降解信號(hào)。而崔雋教授課題組發(fā)現(xiàn)的K63泛素化鏈修飾并非大家所熟知的蛋白降解信號(hào)，但卻能被自噬貨物受體p62識(shí)別并介導(dǎo)蛋白降解，進(jìn)而調(diào)控底物功能，影響生理與疾病進(jìn)程。相同的細(xì)胞在不同的外部因素作用時(shí)，自噬的作用可能不同。對(duì)不同的細(xì)胞，自噬的作用可能不同。

自噬阻止劑可以通過阻止自噬通路中的某種蛋白來實(shí)現(xiàn)阻止自噬，也可以通過直接擾亂溶酶體功能來阻止自噬，因?yàn)槿苊阁w是自噬完成的關(guān)鍵場所。氯喹和羥氯喹是兩種臨床中常用的藥物，較早它們被用于調(diào)整瘧疾，后來又發(fā)現(xiàn)其對(duì)SLE等病有效，它們都是通過降低溶酶體酸性、擾亂溶酶體功能來阻止自噬的。這些分子現(xiàn)在也在臨床實(shí)驗(yàn)中與化療藥物聯(lián)用以降低耐藥性。解決特異性不足的一個(gè)未來的研究方向，是針對(duì)特異性更高的靶點(diǎn)（即該蛋白只存在于自噬通路中）開發(fā)阻止劑/激動(dòng)劑。另外，針對(duì)系統(tǒng)性的脫靶效應(yīng)，可以通過靶向遞送的方式將脫靶效應(yīng)降至較低，例如將自噬阻止劑與化療藥物連接在同一個(gè)靶向到病變的藥物載體上，使其只影響病變中的自噬水平而不干擾免疫系統(tǒng)。在自噬過程中，通過壓力誘導(dǎo)自噬后，細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)被自噬體的雙膜結(jié)構(gòu)隔離。由于自噬對(duì)病細(xì)胞的保護(hù)作用，某些藥物促進(jìn)自噬的作用可能導(dǎo)致病細(xì)胞對(duì)其出現(xiàn)耐藥性。浙江GFP-LC3單熒光自噬

自噬可影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生、趨化作用等。浙江GFP-LC3單熒光自噬

自噬雙標(biāo)系統(tǒng)的工作原理為：未發(fā)生自噬的細(xì)胞及含有自噬體的細(xì)胞中，由于mCherry與GFP共同表達(dá)，細(xì)胞呈現(xiàn)黃色熒光。當(dāng)自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體后，酸性的溶酶體環(huán)境使酸敏感的GFP熒光淬滅，而mCherry不受影響，進(jìn)而使自噬溶酶體呈現(xiàn)紅色熒光。因此，紅色熒光可指示自噬溶酶體形成的順利程度。紅色熒光越多，綠色熒光越少，則從自噬體到自噬溶酶體階段流通得越順暢。反之，自噬體和溶酶體融合被阻止，自噬溶酶體進(jìn)程受阻。浙江GFP-LC3單熒光自噬

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