單細胞轉錄組測序中，制備高質量的單細胞懸液至關重要。而懸液制備好后質檢結果的判斷也是大家需要掌握的必備技能。單細胞懸液質檢關卡究竟是怎樣運作的呢？單細胞懸液質控要求：?細胞濃度：700-1200cells/μl；?細胞活率>80%（當細胞懸液活率低于70%時建議進行去除死細胞處理）；細胞團及碎片雜質<5%（無細胞粘連，無明顯的細胞碎片和細胞團，并保證細胞的完整性）；?細胞狀態(tài)：細胞直徑在7-40um之間（細胞直徑過大則建議進行抽核處理）；?不存在逆轉錄抑制劑和非細胞的核酸分子。關鍵是KBSeq還可以省錢。上海地區(qū)生工生物 高通量測序服務
AO/PI染色原理：吖啶橙（AO）是一種小分子染料，可以通過完整的細胞膜，嵌入所有細胞（活細胞和死細胞）的細胞核，呈現(xiàn)綠色熒光；碘化丙啶（PI）只能通過不完整的細胞膜，即死細胞的細胞膜，嵌入所有死細胞的細胞核，呈現(xiàn)紅色熒光，通過標記出的綠色熒光和紅色熒光就可以辨別出活細胞和死細胞，這種特異性染色的方法也可以排除無核細胞、雜質、碎片等的干擾。熒光細胞計數(shù)儀檢測結果可以讓我們直觀的看到：細胞濃度（總細胞，活細胞，死細胞）、細胞存活率（臺盼藍和雙熒光AO/PI染色）、細胞平均直徑、細胞聚團率、細胞直徑分布等結果的展示。上海地區(qū)多重PCR高通量測序如果是水體樣品，建議采用濾膜過濾后，將濾膜寄送來生工。
對于細胞樣品，送樣量需達到 5 × 106（5乘10的6次方）數(shù)量級。富集后置于 2 ml Ep管中，用 1 ml TRIzol 重懸，注意取樣后立即用液氮或干冰乙醇速凍，保存于-80°C 冰箱，埋于足量的干冰中用保溫箱寄送。強烈建議細胞樣品先做細胞鑒定及支原體/衣原體污染之后，再送出來。對于血液樣本，只接收未凍存過的抗凝血新鮮樣本?？鼓齽┎豢墒褂酶嗡剽c，可用EDTA或ACD抗凝劑，取血后以冰袋保存，切記不能使血液凍結，從取血之時開始計算，須在48小時之內送達生工上海總部高通量測序部。如果不能提供新鮮樣本，則請?zhí)峁难褐刑崛〉目俁NA樣本。備樣要求詳見B、RNA 樣品。
通過顯微鏡使用血球計數(shù)板質檢能觀察到懸液背景質量和細胞數(shù)目及活性的評估。讓我們再來回顧一下臺盼藍染色原理：臺盼藍染色原理：臺盼藍不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不被染色。而死細胞的細胞膜透性增高，可使染料進入細胞內而使死細胞染成淡藍色。怎樣通過血球計數(shù)板進行質檢操作呢？將血球計數(shù)板擦拭干凈，取干凈的蓋玻片蓋在計數(shù)板上；將細胞懸液混勻（或10μl臺盼藍+10μl細胞懸液），吸出10μl懸液至計數(shù)板上蓋玻片的一側使細胞核懸液鋪滿蓋玻片和計數(shù)板之間；在顯微鏡下分別對V1/V2/V3/V4四個計數(shù)區(qū)域進行計數(shù)；按細胞計數(shù)公式進行計算，計算公式：細胞總數(shù)={(V1+V2+V3+V4)/4}*10000*懸液體積*稀釋倍數(shù)，V1/V2/V3/V4為各個計數(shù)區(qū)的細胞數(shù)目，細胞活率=活細胞數(shù)目/總細胞數(shù)目*100%。生工高通量測序部擁有豐富的樣品處理經(jīng)驗，日均處理樣品200余例。
單細胞懸液質檢方法，在進行單細胞懸液質檢時，需要用到以下兩大質檢利器的輔助：熒光細胞計數(shù)儀（主要使用臺盼藍和雙熒光AO/PI染色法）進行質檢。首先我們先要了解一下細胞質檢時染料染色的原理：臺盼藍染色原理：臺盼藍不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不被染色。而死細胞的細胞膜透性增高，可使染料進入細胞內而使死細胞染成淡藍色。熒光細胞計數(shù)儀檢測結果可以讓我們直觀的看到：細胞濃度（總細胞，活細胞，死細胞）、細胞存活率（臺盼藍和雙熒光AO/PI染色）、細胞平均直徑、細胞聚團率、細胞直徑分布等結果的展示。目前，生工生物已開展10x單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）服務，如果正好您有需要，那就快快來call我們吧！生工生物 高通量測序原理
準確、迅速，可以說是KBSeq的代名詞了。上海地區(qū)生工生物 高通量測序服務
生工高通量測序樣品要求，環(huán)境樣品：如果是新鮮土壤/污泥樣品，可以以冰袋運輸，不超過3天;如果是凍存過的樣品（-20°C或者-80°C冰箱保存），為避免反復凍融，建議用足量的干冰（根據(jù)經(jīng)驗，在秋冬季節(jié)，如果打包合適，3公斤塊狀干冰可以維持30-40小時）寄送;如果是水體樣品，建議采用濾膜過濾后，將濾膜寄送來生工。生工不負責過濾。要求濾膜3張，冰袋運輸，不超過3天。其余特殊環(huán)境樣品，具體咨詢生工高通量測序部。
DNA樣品：請?zhí)峁╇娪灸z圖，濃度>20 ng/μl，總量一般1～2 μg。乙醇沉淀DNA或凍干DNA，可冰袋運輸，不超過3天。 上海地區(qū)生工生物 高通量測序服務
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