大腸桿菌外源蛋白表達系統(tǒng)

無細胞蛋白表達技術（CFPS）正在徹底改變合成生物學、生物技術和藥物開發(fā)等關鍵領域，它通過突破傳統(tǒng)大腸桿菌（E. coli）等細胞表達系統(tǒng)的固有局限，實現(xiàn)了三大he xin優(yōu)勢：更快的生產周期更靈活的合成條件調控；可表達毒性蛋白或體內難以合成的復雜結構蛋白；這使得CFPS成為zhi liao性蛋白開發(fā)、功能基因組學和高通量蛋白質篩選不可或缺的工具。由于擺脫了細胞代謝的束縛，CFPS可實時優(yōu)化反應條件，從而明顯提升蛋白產量并優(yōu)化生產效率。添加0.5mM PMSF將 ??體外表達蛋白的降解率??從45%壓制至<5%。大腸桿菌外源蛋白表達系統(tǒng)

nuclera 高通量微流控蛋白表達篩選eProtein Discovery系統(tǒng)

1、從DNA到106μg純化蛋白的時間不到48小時

2、Biacore檢測證實VEGF165與貝伐珠單抗結合具有功能活性，親和力達36pM通過eProteinDiscovery系統(tǒng)進行快速無細胞蛋白表達與純化篩選，次日即可進行蛋白放大生產，這一組合縮短了獲取高質量蛋白以在Biacore系統(tǒng)上進行功能驗證的時間。英國Nuclera公司由劍橋大學的博士生們于2013年創(chuàng)立。在撰寫論文期間，他們發(fā)現(xiàn)蛋白質難以獲取的問題是生物學領域的首要障礙和關鍵瓶頸。他們著手解決蛋白質難以獲取的問題，以期改善人類健康狀況。公司的愿景是打造出從DNA到蛋白質的原型設計系統(tǒng)，以減少在藥物發(fā)現(xiàn)計劃中獲得靶蛋白的時間和障礙。上海曼博生物是Nuclera品牌的官方代理商。 桿狀病毒蛋白表達載體體外蛋白表達技術正在改寫蛋白質研究的??時空規(guī)則??。

無細胞蛋白表達技術因其操作簡單、周期短，已成為生物教學的理想工具。學生可在實驗課中直接觀察綠色熒光蛋白（GFP）的實時合成過程，直觀理解中心法則。在科研中，CFPS被用于研究翻譯調控機制、核糖體功能等基礎問題，例如通過添加特定抑制劑分析蛋白質合成的能量依賴性。從藥物開發(fā)到合成生命，無細胞蛋白表達技術的應用覆蓋了生物醫(yī)學、工業(yè)生物技術和基礎研究。其hexin價值在于打破細胞壁壘，實現(xiàn)“按需合成”，未來隨著自動化與微流控技術的結合，應用場景將進一步擴展。

無細胞蛋白表達的興起可將這一時間縮短至十幾個小時，但是仍需要現(xiàn)進行表達載體的制備，體外擴增和高通量蛋白表達然后再進行篩選等多步操作。Nuclera將這些復雜的流程ji he到eProteinDiscovery系統(tǒng)。該系統(tǒng)使用基于數(shù)字微流控的智能卡盒、蛋白質質量檢測和無細胞蛋白合成，使研究人員更容易快速獲取高質量蛋白質。只要將目標蛋白質的序列輸入配套軟件，就可以利用預設融合標簽定制DNA構建體以優(yōu)化表達，然后將表達載體裝載到機器上，該系統(tǒng)就會通過自動化構建篩選（可同時篩24種DNA構建體x8種無細胞混合物=192種獨特表達條件），根據(jù)可溶性、可純化性和純化產量數(shù)據(jù)確定Zui 佳表達條件，然后放大規(guī)模并獲取蛋白質以供下游應用，從DNA到可用于分析檢測的蛋白質只需要48小時。系統(tǒng)已生產超過2,000種蛋白質，包含多種類型，其中約77%的人類蛋白。蛋白質類型包括伴侶蛋白、水解酶、連接酶、氧化還原酶、信號蛋白、結構蛋白和轉移酶等，分子量范圍為18kDa~300kDa(平均:46kDa)。獲得的難表達蛋白包括膜蛋白、含二硫鍵的蛋白和含高度無序結構的蛋白等，還更容易地篩選和獲取同源物、直系同源物、突變和異構體。通過灌流式反應器將CHO細胞體外蛋白表達??周期縮短至72小時，單批次產量突破5g/L。

體外蛋白表達技術的重點在于利用細胞裂解物中的生物合成機器（核糖體、tRNA、翻譯因子）在試管中直接合成蛋白質。以大腸桿菌系統(tǒng)為例：首先制備含T7啟動子的線性DNA模板，將其與商業(yè)化裂解物（如RocheRTS100）、能量混合物（ATP/GTP）及20種氨基酸混合，在37℃振蕩反應2-4小時即可完成蛋白表達。整個過程無需細胞培養(yǎng)與基因轉染，速度比傳統(tǒng)方法快10倍以上。例如，COVID19刺突蛋白RBD結構域的體外表達只需6小時，而HEK293細胞系統(tǒng)需5天。該技術的關鍵優(yōu)勢是開放體系的可編程性——可直接添加非天然氨基酸（如Azidohomoalanine）合成定制化蛋白，為藥物偶聯(lián)物開發(fā)提供高效平臺。小麥胚芽裂解物??尤其適用于??同位素標記的蛋白表達??用于NMR結構解析。桿狀病毒蛋白表達載體

CHO細胞重組蛋白表達??是生產抗體的常用技術。大腸桿菌外源蛋白表達系統(tǒng)

前沿高校和研究所是無細胞蛋白表達技術創(chuàng)新的源頭。哈佛大學George Church實驗室開發(fā)的"全基因組裂解物"技術，明顯提升了復雜途徑的體外重構能力；東京大學則通過微流控-無細胞蛋白表達技術聯(lián)用系統(tǒng)，推動單細胞蛋白組學研究。值得注意的是，合成生物學公司（如Ginkgo Bioworks、Zymergen）正將無細胞蛋白表達技術納入其自動化生物鑄造平臺，用于高通量酶進化。而傳統(tǒng)發(fā)酵技術公司（如DSM）也開始布局無細胞蛋白表達技術，探索其在可持續(xù)蛋白（如無細胞合成乳清蛋白）中的應用，預示著技術融合的跨界競爭趨勢。大腸桿菌外源蛋白表達系統(tǒng)