1993年，美國科學(xué)家Mulis眾望所歸地獲得了諾貝爾化學(xué)獎，他所取得的成就是發(fā)明了PCR技術(shù)。PCR，中文譯為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其實是一種DNA的快速擴(kuò)增技術(shù)，其擴(kuò)增效率之高就象核裂變的“鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”那樣。PCR技術(shù)通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱的酶的作用，可以在3個小時內(nèi)把特定的DNA量提高1000萬倍。這種技術(shù)一問世，立刻引起了分子生物學(xué)研究的一場**，人們利用這種轟動全世界的技術(shù)很快就把微觀領(lǐng)域的生物學(xué)研究地往前推了一步?？梢赃@么說，PCR技術(shù)使分子生物學(xué)研究一下子獲得了突破，而且隨著PCR技術(shù)的日趨完善，PCR在人類社會生活中的應(yīng)用也越來越。比如說在“DNA指紋”中我們提到，科學(xué)家們只需要一根頭發(fā)甚至一個細(xì)胞就可以完成DNA指紋的鑒定工作，這里實際上就要采用PCR技術(shù)，因為一個細(xì)胞中的DNA含量實在太少了，人們根本不可能檢測到它的指紋；有了PCR技術(shù)就好辦了，通過PCR技術(shù)把這個細(xì)胞中的DN斷擴(kuò)增1000萬倍，這樣DNA量就足夠作指紋鑒定了。再比如，在醫(yī)院里檢驗血液中的某種病毒，有時病毒量極少（例如病毒攜帶者），通過傳統(tǒng)的檢查方法費(fèi)力又費(fèi)時，這時PCR技術(shù)也許就可以幫上忙。可以先選定這種病毒DNA上的一段DNA，設(shè)計合適的引物DNA。 只要樣本有一個病原體存在，PCR就可以檢測到。國產(chǎn)核酸定量PCR儀批發(fā)廠家
而引物3’末端后5到6個核苷酸的錯配應(yīng)盡可能的少。如果3’末端的錯配過多，通過降低反應(yīng)的退火溫度來補(bǔ)償這種錯配不會有什么效果，反應(yīng)幾乎注定要失敗。引物3’末端的另一個問題是防止一對引物內(nèi)的同源性。應(yīng)特別注意引物不能互補(bǔ)，尤其是在3’末端。引物間的互補(bǔ)將導(dǎo)致不想要的引物雙鏈體的出現(xiàn)，這樣獲得的PCR產(chǎn)物其實是引物自身的擴(kuò)增。這將會在引物雙鏈體產(chǎn)物和天然模板之間產(chǎn)生競爭PCR狀態(tài)，從而影響擴(kuò)增成功。引物3’末端的穩(wěn)定性由引物3’末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個堿基的ΔG。此值的大小對擴(kuò)增有較大的影響，負(fù)值大，則3’末端穩(wěn)定性高，擴(kuò)增效率更高，同時也更易于異位引發(fā)。需要注意的是，引物3’末端應(yīng)盡量避免T。實驗證明，以T結(jié)尾的引物即使與T,G或C錯配仍可有效延伸。⑥PCR產(chǎn)物的長度及在耙序列內(nèi)的位置所有的計算機(jī)程序都提供對PCR產(chǎn)物長度范圍的選擇。一般說來，PCR產(chǎn)物長度對擴(kuò)增效率有影響。特定的應(yīng)用情況下，PCR產(chǎn)物長度部分取決于模板材料。預(yù)期產(chǎn)物的特定長度經(jīng)常取決于應(yīng)用的需要。若目的是建立測定特異DN段的臨床檢驗方法，120～300bp的小DNA擴(kuò)增產(chǎn)物可能是好的。產(chǎn)物應(yīng)具有好的特異性和高的產(chǎn)生效率。 上海實驗室PCR儀廠家直銷價DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。
1．一般性原則(1)長度：一般引物互補(bǔ)區(qū)的長度為16-25bp，引物互補(bǔ)區(qū)的4×(G十C)十2×(A十T)不要沒有必要大于70，一般也不要低于50(2)G十c含量：好在45％一55％之間，但有時受模板限制，無法理想化。但在有幾種選擇時，可以把G十c含量接近50%作為參數(shù)之一(3)堿基分布的隨機(jī)性：應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基。尤其是不應(yīng)在其3’端出現(xiàn)超過3個的連續(xù)G或C，否則會使引物在G十C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。(4)引物自身：不能含有很長的牢固的自身互補(bǔ)序列，尤其是引物3‘端回折形成的發(fā)夾不要一般超過3堿基，否則會影響引物與模板的結(jié)合(5)引物之間：兩個引物之間不應(yīng)有很長的牢固的互補(bǔ)或同源堿基，尤應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。2.具體原則①引物長度；特異性一般通過引物長度和退火溫度控制。如果PCR的退火溫度設(shè)置在近于引物Tm值（引物/模板雙鏈體的解鏈溫度）幾度的范圍內(nèi)，18到24個堿基的寡核苷酸鏈?zhǔn)怯泻芎玫男蛄刑禺愋缘?。引物越長，擴(kuò)增退火時被引發(fā)的模板越少。為優(yōu)化PCR反應(yīng)，使用確保溶解溫度不低于54℃的短的引物，可獲得好的效率和特異性。總的來說，好在特異性允許的范圍內(nèi)尋求安全性。每增加一個核苷酸，引物特異性提高4倍；這樣，大多數(shù)應(yīng)用的短引物長度為18個核苷酸。
基因擴(kuò)增儀因操作方便、運(yùn)行速度快、實驗結(jié)果準(zhǔn)確，受到越來越多的分子生物學(xué)研究者青睞。面對各種不同性能的基因擴(kuò)增儀，又該如何選擇呢?基因擴(kuò)增儀的選購誤區(qū)誤區(qū)一：儀器通道越多越好隨著基因擴(kuò)增技術(shù)的成熟運(yùn)用，多重擴(kuò)增越來越熱鬧，基因擴(kuò)增儀也不能幸免。從單通道基因擴(kuò)增儀發(fā)展到如今各個廠家都推出4通道、5通道甚至6通道基因擴(kuò)增儀，眼花繚亂的選擇讓人無所適從，就有人一不小心走進(jìn)了“通道越多越好”的誤區(qū)。在使用有些廠家5通道的基因擴(kuò)增儀時，為了確保實驗結(jié)果的精確性和準(zhǔn)確性都要在實驗中使用ROX或Referencedye，這些熒光染料都必須單獨(dú)使用一個檢測通道。這樣以來，真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個，而且使用校正染料可能會增加后期的使用成本。考慮多重基因擴(kuò)增儀的通道數(shù)的時候也應(yīng)該從實驗室實際情況出發(fā)，多重基因擴(kuò)增儀并非人人適用、人人可用，因為它使實驗復(fù)雜化了。誤區(qū)二：基因擴(kuò)增儀無需梯度功能對于使用染料法的定量PCR反應(yīng)，雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計軟件或者經(jīng)驗公式計算熔解溫度(Tm值)，但運(yùn)用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差異會很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變?nèi)f化，對于特殊片斷。 PCR的三個反應(yīng)（變性-退火-延伸）0步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。
1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DN段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DN段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌thermusaquaticus中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長度。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區(qū)別，將此酶命名為TaqDNA多聚酶TaqDNAPolymerase。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR的被應(yīng)用。 PCR技術(shù)不但能檢測基因的突變,而且能準(zhǔn)確檢測特定基因的表達(dá)量,可據(jù)此進(jìn)行早期診斷,分型,分期和預(yù)后判斷.上海力康實時定量PCR儀廠家報價
通過PCR進(jìn)行基因分型，也是對遺傳病中的突變進(jìn)行遺傳分析的一個基本方式。國產(chǎn)核酸定量PCR儀批發(fā)廠家
PCR實驗室又叫基因擴(kuò)增實驗，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA的片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握生物體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達(dá)納米級別。PCR實驗室運(yùn)行的條件1、必須擁有標(biāo)準(zhǔn)的的PCR熒光實驗室實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由于該技術(shù)不實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。2、檢測設(shè)備必須符合標(biāo)準(zhǔn)PCR熒光實驗室設(shè)置要求熒光定量PCR儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統(tǒng)。3、必須通過國家臨床檢驗中心的驗收和認(rèn)證;4、檢測人員必須通過國家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書。PCR實驗室內(nèi)工作人員必須參加由國家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴(kuò)增培訓(xùn)班，并持證上崗。PCR實驗室通過驗收，實驗室至少必須應(yīng)有兩個以上持有“臨床基因檢測上崗證”。PCR實驗室必須建立嚴(yán)格的實驗室管理制度、建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序（SOP）、建立系列質(zhì)量管理文件等。確保實驗室日常運(yùn)行符合國家衛(wèi)生部的要求，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確、確保實驗室衛(wèi)生安全。國產(chǎn)核酸定量PCR儀批發(fā)廠家
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