上海crispr脫靶檢測(cè)政策

插入突變風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估一些整合性載體（如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、轉(zhuǎn)座子）可將外源基因插入整合到細(xì)胞基因組中，這可能會(huì)導(dǎo)致關(guān)鍵基因突變或jihuo原基因，從而導(dǎo)致惡性liu風(fēng)險(xiǎn)增加。影響插入突變的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因素包括：（1）載體的整合特征，如插入位點(diǎn)的偏好性；（2）載體的設(shè)計(jì)，如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子等構(gòu)建元件的活性，影響鄰近基因的潛力；產(chǎn)生剪接突變體的潛在剪接位點(diǎn)或多聚腺苷酸信號(hào)等；（3）細(xì)胞載體拷貝數(shù)；4）轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的功能活性（如與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)）和表達(dá)水平；5）靶細(xì)胞群的轉(zhuǎn)化可能性，這可能與細(xì)胞的分化狀態(tài)、增殖潛力、體外培養(yǎng)條件和體內(nèi)植入環(huán)境等有關(guān)。檢測(cè)脫靶效應(yīng)比較好的方法:CIRCLE-seq。上海crispr脫靶檢測(cè)政策

gRNA的長(zhǎng)度和錯(cuò)配： 17個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的gRNA顯示出更高的基因組編輯效率。相比之下，18-20 bp的長(zhǎng)度顯示出較低的基因組編輯效率。在人類(lèi)細(xì)胞中減少潛在脫靶效應(yīng)的指導(dǎo)方針：1) 應(yīng)避免在PAM的7-10 bp范圍內(nèi)靶序列有超過(guò)3個(gè)錯(cuò)配；2) 在PAM的12 bp內(nèi)，應(yīng)避免sgRNA 凸起以減少脫靶效應(yīng)。gRNA的化學(xué)修飾：在gRNA核糖磷酸骨架中加入2?-O-甲基-3?-膦?；宜狨?huì)導(dǎo)致位點(diǎn)特異性修飾，使脫靶切割減少40-120倍，同時(shí)保持靶向性能。gRNA上游5'發(fā)夾結(jié)構(gòu)的修飾可以提高Cas9和Cas12的特異性，降低脫靶效應(yīng)。定量脫靶檢測(cè)評(píng)估脫靶檢測(cè)政策，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專(zhuān)業(yè)性高，檢測(cè)效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。

基因zhiliao產(chǎn)品特有的可能會(huì)引起遲發(fā)性不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)因素包括：基因組整合活性基因zhiliao產(chǎn)品可能會(huì)采用修飾宿主基因組的技術(shù)，并有可能在宿主細(xì)胞或組織中持續(xù)存在。很多基因zhiliao載體的基因整合不會(huì)指向基因組的特定位點(diǎn)，可能在整合位點(diǎn)處產(chǎn)生插入突變、或jihuo整合位點(diǎn)附近的原基因等，進(jìn)而破壞重要基因功能或增加惡性liu的風(fēng)險(xiǎn)，例如，國(guó)外已有多項(xiàng)研究報(bào)告在接受了使用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因修飾細(xì)胞zhiliao的受試者中發(fā)生白血病。因此，對(duì)于存在此類(lèi)風(fēng)險(xiǎn)的產(chǎn)品，有必要進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪(fǎng)臨床研究以評(píng)估出現(xiàn)遲發(fā)不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

檢測(cè)方法的敏感度、特異性和可重復(fù)性應(yīng)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，并設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)年?yáng)性和陰性對(duì)照；當(dāng)體內(nèi)靶細(xì)胞或替代細(xì)胞中載體序列陽(yáng)性的比例超出預(yù)期范圍時(shí)，應(yīng)開(kāi)展克隆性生長(zhǎng)的評(píng)估。如果存在優(yōu)勢(shì)克隆或單克隆生長(zhǎng)，應(yīng)在不超過(guò)3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)再次檢測(cè)確認(rèn)，并盡快開(kāi)展整合位點(diǎn)的分析。當(dāng)載體的整合位點(diǎn)確定后，應(yīng)與人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)及基因組的其他數(shù)據(jù)庫(kù)等進(jìn)行比較，確定整合位點(diǎn)的基因功能，評(píng)估是否與包括zheng在內(nèi)的任何疾病有關(guān)。如果受試者體內(nèi)出現(xiàn)載體陽(yáng)性細(xì)胞的克隆性生長(zhǎng)，或檢測(cè)發(fā)現(xiàn)基因整合位點(diǎn)在基因或相關(guān)基因附近，應(yīng)縮短檢測(cè)間隔至不超過(guò)3個(gè)月并密切監(jiān)測(cè)惡性liu征兆，直至檢測(cè)不到基因zhiliao載體。脫靶檢測(cè)方法，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專(zhuān)業(yè)性高，檢測(cè)效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。

由于設(shè)計(jì)的sgRNA會(huì)與非靶點(diǎn)DNA序列錯(cuò)配，引入非預(yù)期的基因突變，即脫靶效應(yīng)(Off-targeteffects)。脫靶效應(yīng)造成了研究中的許多不確定性，這無(wú)疑限制了該技術(shù)的應(yīng)用。因此，研究者希望能開(kāi)發(fā)有效的方法來(lái)檢測(cè)脫靶效應(yīng)。在目前主流的脫靶效應(yīng)評(píng)估方法中，有一種方法為GUIDE-seq，其原理是利用一種短的雙鏈寡聚核苷酸（dsODN）標(biāo)記CRISPR/Cas誘導(dǎo)的脫靶斷裂，然后對(duì)標(biāo)簽所在的基因組區(qū)域進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)分析從而確定脫靶位點(diǎn)。利用該技術(shù)可以在基因組范圍內(nèi)檢測(cè)CRISPR脫靶效應(yīng)，從而改變了以往先預(yù)測(cè)假定脫靶位點(diǎn)再檢測(cè)的思路；與其他的評(píng)估方法相比，GUIDE-seq更精確、更靈敏。選擇潛在的脫靶位點(diǎn)，例如選擇gRNA預(yù)測(cè)網(wǎng)站上Top 5潛在脫靶位點(diǎn)，進(jìn)行Sanger測(cè)序單克??；廣州高精度脫靶檢測(cè)評(píng)估

基因編輯治療過(guò)程中安全性評(píng)價(jià)，即脫靶效應(yīng)的檢測(cè)。上海crispr脫靶檢測(cè)政策

對(duì)基于慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因zhiliao產(chǎn)品，如出現(xiàn)與可復(fù)制xingbing毒可能相關(guān)的不良事件，還應(yīng)開(kāi)展可復(fù)制xingbing毒（replicablecompetentlentivirus/retrovirus，RCL/RCR）的檢測(cè)。關(guān)于基因編輯產(chǎn)品的特殊考慮基因編輯產(chǎn)品除了適用基因zhiliao產(chǎn)品的一般考慮以及整合性載體的特殊考慮外，長(zhǎng)期隨訪(fǎng)中還應(yīng)額外關(guān)注脫靶風(fēng)險(xiǎn)，量化評(píng)估脫靶活性和在靶活性之間的相關(guān)性，或利用在靶活性來(lái)預(yù)測(cè)脫靶活性的水平。如果基因zhiliao產(chǎn)品通過(guò)全身給yaofang式遞送，長(zhǎng)期隨訪(fǎng)中的安全性監(jiān)測(cè)不僅包括靶qiguan或靶組織的脫靶活性，而且還應(yīng)包括可能發(fā)生在其他組織和qiguan中的脫靶活性。上海crispr脫靶檢測(cè)政策