負(fù)對(duì)照有信號(hào)引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。鎂離子濃度過(guò)高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。模板有基因組的污染：RNA提取過(guò)程中避免基因組DNA的引入，或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。擴(kuò)增效率低反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時(shí)所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋?zhuān)偌尤敕磻?yīng)體系中，減少抑制物的影響。SYBRGreen法qPCR機(jī)構(gòu)哪家靠譜？河南相對(duì)定量qPCR服務(wù)Real-time PCR 中引物設(shè)計(jì)的好...

實(shí)時(shí)熒 光 定 量 PCR 的 擴(kuò) 增 曲 線可 由 4 個(gè) 時(shí) 期 進(jìn) 行 描 述，即基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期、線性增長(zhǎng)期與平臺(tái)期。在基線期 部分，強(qiáng)背景信號(hào)掩蓋了微弱的熒光信號(hào)，故此時(shí)期無(wú)法對(duì)模 板的起始量進(jìn)行分析。反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期，反應(yīng)管內(nèi)的 dNTP、 酶等被耗盡，反應(yīng)環(huán)境已不適合 PCR 反應(yīng)的進(jìn) 行，此 時(shí) 的 PCR 產(chǎn)物不再增加，熒光信號(hào)達(dá)到水平狀態(tài)，且同一模板的 多次技術(shù)重復(fù)的擴(kuò)增曲線在該時(shí)期重復(fù)性差、可變性高，故 在這一時(shí)期同樣不適合進(jìn)行模板初始量的分析。在線性增 長(zhǎng)期，雖然 PCR 反應(yīng)仍在進(jìn)行，但產(chǎn)物已不再呈指數(shù)形式增 ...

切斷探針后 , FAM 與 TAM RA 分離 ,熒 光信號(hào)得到釋放。這時(shí)熒光探測(cè)系統(tǒng)就能檢測(cè)到光 密度有所增加。模板每復(fù)制 1 次, 就有 1 個(gè)探針被 切斷 ,并有 1 個(gè)熒光信號(hào)被釋放。由于理論上被釋 放的熒光基團(tuán)數(shù)和 PCR 產(chǎn)物數(shù)是一對(duì)一的關(guān)系 ,且 光密度同被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)也呈正比關(guān)系 ,因此 該技術(shù)可對(duì)模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。但 T aqM an 也存 在一定不足 ,主要表現(xiàn)在:①由于采用熒光和淬滅基 團(tuán)雙末端標(biāo)記,因此淬滅難以徹底,本底較高。 ②報(bào) 告基團(tuán)的水解利用的是 Taq 酶的 5' ※3' 外切活性, 因此定量時(shí)容易受酶活性影響。 ③探針標(biāo)記成本較 高 ,不便普及應(yīng)用。Ta...

耐藥基因表達(dá)的研究：目前研究中發(fā)現(xiàn)主要的 耐藥機(jī)制有：ATP結(jié)合盒基因超家族的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo) 的耐藥，這些蛋白包括：MDR-1基因編碼的P-糖蛋白， 多藥耐藥相關(guān)蛋白，肺耐藥相關(guān)蛋白，乳腺耐藥蛋 白等；酶介導(dǎo)的耐藥，包括拓?fù)鋵?dǎo)構(gòu)酶，谷胱甘肽及谷 胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，蛋白激酶C，脫氧胞嘧啶核苷激酶等， 凋亡基因介導(dǎo)的耐藥，如bcl-2家族，p53基因，c-myc 等。多藥耐藥是多因素，多種機(jī)制共同作用的結(jié)果。 real-time反轉(zhuǎn)錄 PCR是了解耐藥指導(dǎo)臨床策 略的有用手段，它能觀測(cè)用藥前后及復(fù)發(fā)時(shí)細(xì)胞的 耐藥基因mRNA表達(dá)變化...

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)的分類(lèi)：熒光探針?lè)ǎ核馓结樂(lè)?。水解探針的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是寡核苷酸序列 的 5′端為熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端 為 熒 光 淬 滅 基 團(tuán)。PCR 擴(kuò) 增 前，探針游離于靶序列外，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán) 吸收，檢測(cè)不到熒光，但有時(shí)會(huì)因淬滅不徹底，會(huì)檢測(cè)到微 弱的熒光。在 PCR 退火時(shí)，探針特異性地結(jié)合到靶序列上， 在延伸階段，利用 Taq 酶 5′-3′外切酶的活性將探針?biāo)猓? 熒光報(bào)告基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)分離，熒光信號(hào)被釋放，并與 PCR 產(chǎn)物的數(shù)量成正相關(guān)。由于水解探針的作用機(jī)理依賴(lài) 于 Taq 酶 5′-3′外切酶的...

x - 軸表示 PCR 循環(huán)數(shù), y - 軸表示擴(kuò)增 反應(yīng)的熒光值 ,與反應(yīng)管中擴(kuò)增產(chǎn)物的量有比例關(guān) 系。擴(kuò)增曲線有指數(shù)增長(zhǎng)期和非指數(shù)平臺(tái)期 2 個(gè)階 段。在指數(shù)增長(zhǎng)階段,每個(gè)循環(huán) PCR 產(chǎn)物量大約增 加一倍。然而隨著反應(yīng)的進(jìn)行, 反應(yīng)體系組成成分 的消耗,反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期。只有在熒光信號(hào)擴(kuò)增期 PCR 產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值 與起始模板量之間存在線性關(guān)系 , 可以在指數(shù)期的 某一點(diǎn)上來(lái)檢測(cè) PCR 產(chǎn)物的量,并由此推斷模板初始的含量。設(shè)定一定的熒光信號(hào)的域值 (thresh - old)。如果檢測(cè)到熒光信號(hào)超過(guò)域值, 就被認(rèn)為是 真正的信號(hào) ,它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù) Ct (C 表示循環(huán) cy...

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的數(shù)據(jù)分析 在指數(shù)增長(zhǎng)期，PCR 產(chǎn)物量以指數(shù)形式增加，根據(jù)這一 原 則，假設(shè)擴(kuò)增效率為 E，模 板 起 始 量 為 N0，m 個(gè) 循 環(huán) 后 PCR 產(chǎn)物量為 Nm，則有 Nm=N0（1+E）m（1），對(duì) 該 等 式 兩邊 取 對(duì)數(shù)，則有 LgN0=-m·lg（1+E）+Lg Nm（2），若循環(huán)數(shù)達(dá)到某一 CT 值時(shí)，熒光閾值為 Q，式（1）可寫(xiě)成：Q=N0（1+E）CT，式（2） 可 寫(xiě) 成 ：LgN0=-CT·lg （1 +E） +LgQ。 當(dāng) 需 要 對(duì) 靶 基 因 在 mRNA 水平上進(jìn)行表達(dá)量分析時(shí)，通 常 采 用...

Absolute Quantification 標(biāo)準(zhǔn)曲線的各 項(xiàng)指標(biāo)：斜率、擴(kuò)增效率（E）、相關(guān)系數(shù)（R2 ）、間距均需進(jìn)行 嚴(yán)格評(píng)價(jià)，從而確保該曲線的可用性。各點(diǎn)間距應(yīng)相等，間 距以及斜率的Absolute 值應(yīng)滿(mǎn)足 3.100~3.582，相關(guān)系數(shù) R2＞0.99， 擴(kuò)增效率（E）在 90%~110%之間。擴(kuò)增效率、斜率以及間距 三者相互關(guān)聯(lián)，擴(kuò)增效率（E）=10（-1/斜 率 ） -1，斜率的Absolute值恰 是各點(diǎn)之間的平均間距。當(dāng)擴(kuò)增效率＜90%時(shí)，間距以及 斜 率的Absolute 值會(huì)＞3.582；當(dāng)擴(kuò)增效率＞110%...